真核基因組dna提取-wenkub
2023-05-22 00:43:09 本頁面
【正文】 在分離過程中要加入一定的 RNase抑制劑。 對(duì)于 RNA，因分子較小，不易被機(jī)械剪切力拉斷，但抑制 RNase活力較難，故在 RNA提取中設(shè)法抑制 RNase更重要。 ? 核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求： ①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； ②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 核酸制備的一般原則 ① 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程。 核酸制備的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制 ① 加入少量 金屬離子螯合劑 ，如 mol/L EDTA或檸檬酸鈉， DNase基本可以全部失活。 核酸制備中常用的去垢劑 用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3．對(duì) RNase、 DNase有一定的抑制作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、 DEPC 1）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、 SDS裂解。 細(xì)胞器 DNA：首先純化細(xì)胞器。 ? 在 EDTA（螯合二價(jià)陽離子以抑制 DNase）存在的情況下，將分散好的真核生物組織、細(xì)胞用 蛋白酶 K消化 真核細(xì)胞或組織并分解蛋白質(zhì)， ? 用 SDS溶解細(xì)胞質(zhì)并使蛋白質(zhì)變性從而與 DNA分子分離，使 DNA分子以可溶形式存在于溶液中。 ? 由于真核生物基因組較大，操作時(shí)應(yīng)注意輕柔，最大限度地減少機(jī)械和化學(xué)作用對(duì)DNA的剪切，從而獲得相對(duì)完整的 DNA。因此，一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的 OD260、 OD280 和 OD230計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。 ?有些分光光度計(jì)則顯示 OD260/OD230，其比值應(yīng)在2~，偏小則說明有殘余鹽剩余。 瓊脂糖凝膠制備及電泳 凝膠制備 倒膠 點(diǎn)樣 電泳 紫外燈下觀察 凝膠準(zhǔn)備 （ %） :用 1 TAE配制 1％瓊脂糖凝膠。 ③ 撥出梳子，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于 電場(chǎng)負(fù)極 。 上樣緩沖液（ loading buffer） 作用：指示劑；沉降作用（含甘油），防止漂樣。 思考題 ? 1. 簡(jiǎn)述真核基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 ?應(yīng)用于 ?構(gòu)建基因組文庫(kù) ?southern雜交 ?PCR技術(shù) 44 ?基因組 DNA文庫(kù)（ genomic DNA library） 從生物組織細(xì)胞 提取出基因組 DNA，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將 DNA降解成預(yù)期大小的片段 ，然后將這些片段 與適當(dāng)?shù)妮d體 （常用噬菌體、粘?；?YAC載體） 連接 ， 轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞 ，這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組 DNA片段與載體連接的重組 DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增， 許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因組各 DNA片段克隆的集合體 。 ? 由于 Southern 印跡雜交的高靈敏度和高特異性，它廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測(cè)、 DNA指紋分析和 PCR產(chǎn)物判斷等研究中。 總 RNA的提取 提取 RNA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵 ___嚴(yán)格防止 RNase的污染 核糖核酸酶 (RNase): 催化降解 RNA為小分子片段的核酸酶 無處不在 體內(nèi)： 取材要新鮮或液氮保存； 破碎細(xì)胞要快，盡量在低溫下進(jìn)行 體外： 空氣、試劑、耗材及實(shí)驗(yàn)者本身 體外 RNAase的去除 ? ① 所用的各種器皿：將玻璃器皿、離心管、吸頭等浸泡于% DEPC溶液中 37℃ 下處理 12 h， 121℃ 高壓滅菌 30 min，再烘干。 RNA提取原理 ? 商業(yè)化試劑盒（ RNAiso plus試劑、 TRIzol reagent）中含有 強(qiáng)變性劑（如異硫氰酸胍）， 能夠充分裂解細(xì)胞，溶解蛋白質(zhì)，使核蛋白與核酸分離。
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