【正文】 173m24 572m14 1082a18 266 e23 275j11 270i10 333a0234l06 ctb159n23 168l03 ctc237n12 382a21 ctc371o18 126l09 163d23 AC055767 767c01502k05 326o24 ctb140o19 415k13 224m20 167k17219m19 266j06 438j01 627c01 659g04AC007791 263i01 596j09 996c06 338p06 606c06ctc243a06 ctc371o18 357l24 94a14 380a22 70i11citb243a06 af176815 ctb177n07 115g03 109j15781a02 412a07 429f161020a11 ctb187p01 622i12402p11 45b16439f04 105h193 pterBeijing Map BAC Po oling Proto col 1 , 1 5 2 ( p l a t e s ) X 3 8 4 ( w e l l s / p l a t e ) X 1 ( B A C / w e l l ) = 4 4 2 , 3 6 8 B A C 4 8 X 8 ( 板 ) X 3 8 4 ( 孔 / 板 ) X 1 ( BAC/ 孔 ) = 1 4 7 , 4 5 6 B A C Ea ch BAC c lone cont ai n ~ 150 Kbp hum an insert 147,456 BAC clo nes 對(duì)全基因組的 覆蓋率 ： 1 4 7 , 4 5 6 B A C c l o n e s X 150 K bp = The genom e DN A 3,000,000 Kbp 共48個(gè) 每組 8 個(gè) 每 8個(gè) 96孔板組成 1個(gè) superpool， 384個(gè) 96孔板組成 48個(gè) superpools 48 superpools Column pools Row pools 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 第八板 第二板 Plate pools第一板 plate pools， row pools， column pools的構(gòu)成 “STSPCR反應(yīng)池 ” 方案（ Pooling Protocol） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 超級(jí)池（ 8個(gè) 96孔板，共 768個(gè)克?。? 板池（ 96個(gè)克?。? 行池（ 12個(gè)克?。? 列池（ 8個(gè)克?。? 大大減少篩選的工作量，降低成本，所得篩選結(jié)果準(zhǔn)確可靠 28 VS 768 sheet of superpools, plate pools, row pools, column pools 一 BAC Screening 前 48個(gè)樣品為引物 superpool(sp)的篩選結(jié)果 后 48個(gè)樣品為引物 superpool(sp)的篩選結(jié)果 引物 sp27,34,45的 plate,row,column pools的篩選結(jié)果 BAC clone 確定 (+為陽(yáng)性克隆 ) 引物 ColonyPCR 延 伸 克 隆 的 篩 選 STS的密度尚未達(dá)到繪制高精度物理圖譜的要求，且在基因組中的分布不均勻，造成很多區(qū)域沒(méi)有陽(yáng)性克隆覆蓋 ,形成空洞。 ? 轉(zhuǎn)錄圖譜 利用 EST（ expressed sequence tags 表達(dá)序列標(biāo)簽）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜 ? 序列圖譜 通過(guò)基因組測(cè)序得到的，以 A、 T、 G、 C為標(biāo)記單位的基因組 DNA序列 逐步克隆法 （ Clone by Clone) 物理圖譜的構(gòu)建 大片段克隆的篩選 霰彈法測(cè)序與“工作框架圖”的構(gòu)建 序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建 物理圖譜的制作 物理圖譜的制作 ——序列標(biāo)簽位點(diǎn)（ STS）作圖 物理圖譜 是以特異的 DNA序列為標(biāo)志所展示的染色體圖。 ? “ JUNK DNA”的發(fā)生、分類、進(jìn)化與功能。 ? 最小內(nèi)含子的生物學(xué)意義。 基因組與生命之謎 ? 基因組的產(chǎn)生與進(jìn)化。 ? 基因組學(xué)的復(fù)雜性必然導(dǎo)致多學(xué)科的引進(jìn)和介入（各生物學(xué)科、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、電子工程學(xué)、考古學(xué)等）。 ? 基因組信息正在以天文數(shù)字計(jì)算，規(guī)?；胤e累，它的深入研究必將形成一個(gè)嶄新的學(xué)科。 ? 基因組學(xué)研究包括對(duì)基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學(xué)研究。 ? 基因組作為信息載體，它所儲(chǔ)存的信息是最基本的生物學(xué)信息之一；既是生命本質(zhì)研究的出發(fā)點(diǎn)之一，又是生物信息的歸宿。 ? 基因組的起源與進(jìn)化和物種的起源與進(jìn)化一樣是一個(gè)新的科學(xué)領(lǐng)域?；蚪M學(xué)的研究又在于基因組間的比較。 ? 人類基因組計(jì)劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。 ? 內(nèi)含子（尤其是大于 100， 000 核苷酸的大內(nèi)含子）剪出后的運(yùn)輸和降解。 ? 基因組大小變化與遺傳、分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系。 8X) Gap1 Gap2 Chromosome 工作草稿（框架圖）與完成圖 BAC by BAC The sequence of the human genome C. Venter et al. Science 16 Feb. 291: 1304 – 1351, 2022 人類基因組計(jì)劃研究的主要成果和進(jìn)展表現(xiàn)在這 “ 四張圖 ” 上 ? 遺傳圖譜 又稱為連鎖圖譜（ linkage map），指基因或 DNA標(biāo)志在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離 ? 物理圖譜 以定位的 DNA標(biāo)記序列如 STS作為路標(biāo)，以 DNA實(shí)際長(zhǎng)度即 bp、 kb、 Mb為圖距的基因組圖譜。 STS圖譜 是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一， STS（ Sequence Tagged Site)本身是隨機(jī)地從人類基因組上選擇出來(lái)的長(zhǎng)度在 200～ 300bp左右的特異性短序列（每個(gè) STS在基因組中是唯一的， STS圖譜就是以 STS為路標(biāo)（平均每 100Kb一個(gè)），將 DNA克隆片段有序地定位到基因組上。 Contig 1 Contig 2 重疊序列 重疊序列 延伸引物 篩選到的延伸克隆 20 kb ~300 bp Molecular weight marker every 5th lane BAC clones 在 96深孔 板中培養(yǎng) Hind III 完全酶切 1% 瓊脂糖凝膠電泳 指 紋 圖 譜 法 （ Walking by Fingerprinting database） 挑取靠近空洞的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在 FPC數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達(dá)到延伸目的。并可及時(shí)進(jìn)行 walking，篩選新的克隆 霰彈法測(cè)序組裝與 Finishing 工作流程圖 Shotgun Sequencing I :RANDOM PHASE Bac Clone: 100200 kb Sheared DNA: kb Sequencing Templates: Random Reads Shotgun Sequencing II:ASSEMBLY Consensus Sequence Gap Low Base Quality Single Stranded Region MisAssembly (Inverted) Consensus Sequence Gap Low Base Quality Single Stranded Region MisAssembly (Inverted) Shotgun Sequencing III: FINISHING Consensus Sequence Gap Single Stranded Region MisAssembly (Inverted) Shotgun Sequencing III: FINISHING Consensus Sequence Gap MisAssembly (Inverted) Shotgun Sequencing III: FINISHING Consensus MisAssembly (Inverted) Shotgun Sequencing III: FINISHING Shotgun Sequencing III: FINISHING High Accuracy Sequence: 1 error/ 10,000 bases Consed軟件顯示序列組裝結(jié)果界面 Filling ―intraclone gaps‖ BAC453F3’s finishing Sp6 T7 ? First 4 primers 1 2 3 4 All the contigs walked hundreds’ bps toward the gaps. 453F3’s 2600 reads 12 contigs Overlapping BAC454F24’s 200 reads + Sp6 T7 1 3 2 4 a b c Second 3 primers 1200bp’s ATrich , (CATATATA)n repeat. Finally, filled by using ET sequencing Kit . 1240bp’s GCrich, GCcontent is % 。 for phred: p = , Q = 20。 BIG