植物原生質(zhì)體的分離實驗(已修改)
2025-04-29 04:15 本頁面
【正文】 n 當(dāng)前文檔修改密碼：8362839實驗一 植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)一．教學(xué)目標(biāo)：了解植物原生質(zhì)體作為細(xì)胞工程研究的重要意義，了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。掌握分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的技術(shù)、方法和原理。掌握細(xì)胞活性的檢測方法。掌握細(xì)胞計數(shù)的原理和方法。二．重點：掌握分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的技術(shù)、方法和原理。掌握細(xì)胞活性的檢測方法。掌握細(xì)胞計數(shù)的原理和方法。三．難點：分離和培養(yǎng)原生質(zhì)體的技術(shù)。四．授課方式與教學(xué)方法：講解原理、實驗操作示范或具體指導(dǎo)。五．教學(xué)內(nèi)容:實驗原理植物原生質(zhì)體(protoplast)是除去細(xì)胞壁后 為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”,是開展基礎(chǔ)研 究的理想材料。其中,酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù),其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維 素、半纖維素和果膠質(zhì)組成,因而使用纖維素 酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分,除 去細(xì)胞壁,即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi) 部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜,必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生質(zhì)體分離后不致膨脹破裂，滲透劑常用甘露醇或蔗糖，酶液還應(yīng)含一定Ca2+來穩(wěn)定原生質(zhì)膜。 其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液 的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質(zhì) 體的影響。將原生質(zhì)體接種在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞壁再生，細(xì)胞分裂和再生植株。測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD 本身無熒光,無極性,可透過完整的原生質(zhì)膜。 一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后,由于受到酯酶分解而產(chǎn)生 具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原 生質(zhì)膜,因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光,無活力 的原生質(zhì)體不能分解FAD無熒光產(chǎn)生。 細(xì)胞計數(shù)一般用血細(xì)胞計數(shù)極，按白細(xì)胞計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)。從理論上講，植物體的任何一部分都可以通過酶解作用去除細(xì)胞壁而得到原生質(zhì)體。但在實際操作中，只有幼嫩的組織才能完成去壁的過程。所以，為了制備健康的原生質(zhì)體，一般選用根尖、莖尖、嫩葉及對數(shù)生長期的愈傷組織為材料，一旦細(xì)胞具有木質(zhì)化或次生加厚的外壁，則不能被酶降解。因此，取材成為實驗成功與否的首要問題。 花期短的花瓣，由于其組織鮮嫩，又具有色素標(biāo)記，是該實驗中較好的材料。實驗方法1．把葉片(或花期短的花瓣)洗凈，把表面水吸干。（2人一組）2．撕去葉片背面的表皮，用2ml離心管的蓋打下1圓片。圓片扣壓于 。讓去除下表皮的一面接觸酶液，輔滿一層。（酶液：4%纖維素酶， 2%果膠覆酶，）。3．28~30℃保溫酶解2~6h（放培養(yǎng)箱中）；鏡檢葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體。用血球計數(shù)板計數(shù)。4．600 rpm 離心5min，使原生質(zhì)體沉降。吸除上面的酶液。5． mol/L ，輕輕吹打均勻。6．用1mL注射器向離心管底部緩緩注入20%的蔗糖溶液1ml，出現(xiàn)下部蔗糖液， min，在兩液相之間出現(xiàn)一條綠色帶，便是純凈的原生質(zhì)體。7．用1mL注射器取出管底的雜質(zhì)、下部蔗糖溶液和上部氯化鈣液。少許原生質(zhì)體于載片上，蓋片觀察其形態(tài)，檢測純度。8．加MS培養(yǎng)液液1ml洗滌，輕輕混勻，600 rpm 離心5min，使原生質(zhì)體沉降。吸除上面的溶液。9．, 輕輕混勻, 用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞密度, FDA染色測定原生質(zhì)體的活性。10．扣上蓋子，在26℃下進(jìn)行暗培養(yǎng)。觀察細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞分裂。實驗結(jié)果結(jié)果討論六．課堂小結(jié)：根據(jù)學(xué)生的實驗結(jié)果進(jìn)行總結(jié)。 細(xì)胞計數(shù)板的使用：細(xì)胞計數(shù)板系一長方形厚玻片
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