【正文】 2020級基因工程復(fù)習(xí)題 名詞解釋 ： 是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能特異識別雙鏈 DNA 中的特 定堿基序列，并在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。 ： 來源不同、識別序列不同，但切割后能產(chǎn)生相同黏性末端的限制性核酸內(nèi)切酶。 ： 一類從多核苷酸的末端開始逐個降解核苷酸的酶。 ： 一類來源于不同微生物、能識別相同序列的限制性核酸內(nèi)切酶。 ： 是依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶，是分子克隆中重要的核酸酶之一。 ： 識別序列相同、但切割位點與原型酶不同的酶。 ： 是指當(dāng)條件改變時，許多酶的識別位點會改變，導(dǎo)致識別與切割序列的非特異性的現(xiàn)象。 ： 存在于多種宿主細(xì)胞、獨立于染色體外的可以自主復(fù)制閉合環(huán)狀的 DNA 分子。 ： 其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個細(xì)胞中有幾十到幾百個拷貝數(shù)的質(zhì)粒。 ： 不賦予寄主細(xì)胞任何表型或者究竟賦予寄主細(xì)胞何種表型，迄今仍未清楚，因此特稱這類質(zhì)粒為隱蔽質(zhì)粒。（自己搜的，正確性不明確） ： 染色體具有復(fù)制功能，利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源 DNA 片段復(fù)制的載體。 ： 可攜帶外源 DNA 片段進(jìn)入 宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯的載體，即用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的載體。 : 克隆和運載目的基因并轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增的載體。 ： 限制性核酸內(nèi)切酶在識別序列的對稱軸上切割形成的片段末端。 ：是指 DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來 。 PCR： 由已知的一段 DNA 序列向兩端擴(kuò)增未知核苷酸序列并能快速獲得未知序列的PCR 操作。 平臺效應(yīng)： PCR 反應(yīng)經(jīng)過一定 數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的對數(shù)積累趨于飽和， DNA片段不再呈指數(shù)積累，而進(jìn)入線性增長期或靜止期的過程。 ： 同一種氨基酸具有兩個或更多個密碼子對應(yīng)，即一段氨基酸序列可以有多個可能的編碼序列。 ： 是為轉(zhuǎn)錄提供終止信號的一段 DNA 序列。 ： 基因工程中克隆的目標(biāo) DNA 分子。 ： 遺傳信息從 DNA 轉(zhuǎn)到 mRNA，再到蛋白質(zhì)的過程。 ： 雙鏈 RNA 對基因表達(dá)的阻斷作用稱為 RNA 干擾。 ： 處于能吸收外源 DNA 分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。 ： 用來編碼一段短肽不同堿基序列的混合物。 ： 是遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)啟動子并提高轉(zhuǎn)錄效率的一段 DNA 序列。 ： 是 RNA 聚合酶識別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段 DNA 序列。 ： 是遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)啟動子并降低轉(zhuǎn)錄效率的一段 DNA 序列。 ： 是一種定點突變技術(shù)，將靶基因的一段 DNA 刪掉，并用人工化學(xué)合成所具有的突變核苷酸的雙鏈寡核苷酸片段取代的技術(shù)。 ： 指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。 文庫： 利用某種生物的總 mRNA 合成 cDNA，再將這些 cDNA 與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱 cDNA 文庫。 ： 細(xì)菌獲得外源質(zhì)粒 DNA，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過程。 ：指轉(zhuǎn)基因生物中的目的基因在生物個體、種群甚至物種間自發(fā)移動是過程。 ： 是安全評價的起點，是指以有安全食用歷史的傳統(tǒng)食品為基礎(chǔ)，要求轉(zhuǎn)基因食品和它所替代的傳統(tǒng)食品至少要同樣安全。 ： 兩個相鄰核苷酸之間缺少一個磷酸二酯鍵 ： 缺少一個或幾個核苷酸 :多克隆位點 :酵母人工染色體 :哺乳動物人工染色體 :可轉(zhuǎn)移人工載體 填空題 1. 基因工程常用的 DNA 連接酶有兩種：一個是（ 大腸桿菌 ） DNA 連接酶，由 NAD+供能，另一個是（ T4 ） DNA連接酶，由 ATP 供能。 2. 在 DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起（有效防止細(xì)菌和核酸的污染）的作用。 3. 對于雙鏈 DNA 分子，在一條鏈上失去了一個磷酸二酯鍵稱為（切口），失去一段單鏈稱為（缺口）。 ，第一個大寫字母取自（微生物屬名）的第一個字母，第二、三個字母取自（種名）的前 2 個字母，第四個字母用株名表 示。 LacI 標(biāo)記基因插入外源基因，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)，在 Xgal 培養(yǎng)基中顯（白）色，為（陽性）克隆，未插入基因的克隆顯（藍(lán)）色，為（陰）性克隆。 、缺失或插入后，可使遺傳信息產(chǎn)生三種不同的后果，分別是（同義突變）、（錯義突變）、和無義突變。 DNA 時，要戴手套操作，原因是手上有（ 核酸酶 ）。 DNA 的原理是（乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對 DNA很安全，是理想的沉淀劑。） （ 結(jié)合型 ）質(zhì)粒和非結(jié)合型質(zhì)粒，依 據(jù)可否引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)新性狀分為顯性質(zhì)粒和（ 隱性質(zhì)粒 ），根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制性可分為嚴(yán)緊型質(zhì)粒和（松弛型質(zhì)粒）。 pBR322 系列質(zhì)粒的細(xì)菌前，需在培養(yǎng)基中加入一定濃度的氯霉素，此氯霉素的作用是（抑制蛋白質(zhì)合成，阻止細(xì)菌染色體復(fù)制）。 （限制酶）、（連接酶）、（聚合酶）、（修飾酶） 4 類。 2 類： DNA 探針和 RNA 探針。其中 DNA 探針又分為（單鏈 DNA 探針）和（雙鏈 DNA 探針） 感受態(tài)出現(xiàn)的生理時期是（對數(shù)生長期） 粒 pBR322 的抗四環(huán)素基因插入一個外源 DNA，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，就不可以再用四環(huán)素篩選出這種細(xì)菌了，這種現(xiàn)象稱為（插入失活）。 DNA插入 EB的量不同，電泳時遷移率也不同， SC DNA的泳動速度最（快），OC DNA 泳動速度最（慢）， L DNA 居中，通過凝膠電泳和 EB 染色的方法可將不同構(gòu)型的 DNA分別開來。 是（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的簡稱， PCR 反應(yīng)體系的基本要素有（緩沖液）、（模板）、(dNTP ）、（引物）等。 的構(gòu)建元件來源于三個親本質(zhì)粒：① pSE2124： 提供 Ampr 基因； ② pMB1：提供 Colel 松弛型 (復(fù)制子 )(Ori)；③ pSC101：提供 (Tetr)基因。 簡答題、論述題 ？ 答：基因工程：在體外將外源基因進(jìn)行切割并與一定的載體連接，構(gòu)成重組 DNA 分子并導(dǎo)入相應(yīng)受體細(xì)胞，使外源基因在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制、表達(dá)，使目的基因大量擴(kuò)增或得到相應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物或進(jìn)行定向改造生物性狀的過程。 技術(shù)流程環(huán)節(jié)： ①目的基因的克隆 ②載體的準(zhǔn)備 ③目的基因與載體的連接 ④重組 DNA 轉(zhuǎn)化 /轉(zhuǎn)染 /轉(zhuǎn)導(dǎo) ⑤重組體的篩選與鑒定 ⑥重組體的大量培養(yǎng) ，外源基因表達(dá)效應(yīng)的分析與開發(fā)應(yīng)用 應(yīng)滿足的 條件是什么？ 答：（ 1）具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，能攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞； （ 2）能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并實現(xiàn)外源基因的增殖； （ 3）具有由單一限制性內(nèi)切酶識別位點組成的多克隆位點，可供外源基因插入； （ 4）具有合適的選擇性標(biāo)記，用于含有重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞篩選。 原理、反應(yīng)體系和基本過程： 答：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）：是 Kary Mullis 于 1985 年發(fā)明的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。 1) PCR 技術(shù)原理： 類似于 DNA 的天然復(fù)制過程， 其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。即在體外適合的條件下，在引物、模板、 dNTP、 Mg2+存在的情況下，由 DNA 聚合酶催化 dNTP合成 DNA 的反應(yīng)。 2) PCR 反應(yīng)體系： ① 緩沖液 ②模板 ③ dNTP ④耐熱的 DNA 聚合酶 ⑤引物 ⑥最佳反應(yīng)條件 PCR 由變性 退火 延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： ①模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 93℃左右一定時間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； ②模板 DNA 與引物的退火 (復(fù)性 )：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； ③引物的延伸： DNA 模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 ？ 答：（ 1） DNA 樣品的純度 （ 2） DNA 樣品的甲基化程度 （ 3）緩沖液性質(zhì) （ 4）酶切反應(yīng)的溫度 （ 5）酶的純度 （ 6） DNA 分子的構(gòu)型 （ 7）酶的星號活性 ？論述在什么情況下使用這些方法？ 答：① Southern 雜交：是將 DNA 片段從瓊脂糖轉(zhuǎn)移到濾膜上。檢測特點 DNA ② Northern 雜交：檢測某一特定 RNA 分子的方法，可用于 RNA 定性和定量分析。 ③菌落雜交：挑選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。用于重組噬菌斑克隆篩選。 ④斑點印跡雜交和狹線印跡雜交：主要用于基因組中特定基因及其表達(dá)情況的定性或定量研究。 ⑤ Western 雜交：檢測可知被檢生物細(xì)胞內(nèi)目的蛋白的表達(dá)與否，表達(dá)量及分子質(zhì)量等。 ⑥液相雜交：核酸酶 S1 保護(hù)分析法、引物延伸分 析法和抑制性消減雜交等。 ，其影響因素有哪些？ 答：連接反應(yīng)：在 DNA 連接酶的作用下，將外源基因 DNA 片段和線性質(zhì)粒 DNA 連接起來構(gòu)成重組質(zhì)粒的過程。 影響因素： ①反應(yīng)溫度 ②連接酶濃度 ③ ATP濃度 ④ DNA片段末端 ⑤插入片段與載體的濃度比例 ，其優(yōu)缺點是什么？ 答：優(yōu)點： ①遺傳背景清楚 ②培養(yǎng)周期短 ③目標(biāo)基因表達(dá)水平高 ④抗污染能力強(qiáng) ⑤代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚 ⑥有大量可供選擇利用的表達(dá)載體 缺點： ①缺少真核基因產(chǎn)物的加工系 統(tǒng)，目標(biāo)蛋白無特定空間構(gòu)象 ②內(nèi)源蛋白質(zhì)會降解表達(dá)產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白，造成目標(biāo)蛋白不穩(wěn)定。 ： 答：①目的基因的獲得； ②基因文庫第一條鏈的合成； ③基因文庫第二條鏈的合成，即雙鏈的合成； ④λ噬菌體載體的構(gòu)建，與目的基因相互連接，形成重組子； ⑤導(dǎo)入宿主細(xì)胞中（如大腸桿菌）進(jìn)行整合、擴(kuò)增、克隆重組子 ⑥重組子的篩選與鑒定 ： 答：（ 1）基因組 DNA 的分離制備 （ 2）基因組 DNA 的片段化 （ 3）載體制備 （ 4）重組連接 （ 5） 噬菌體離體包裝 （ 6）重組噬菌體感染大腸桿菌 基因文庫構(gòu)建的步驟： 答：（ 1）細(xì)胞總 RNA 的提取和 mRNA 的分離 （ 2）第一條 cDNA 合成 （ RnaseH 的作用） （ 3）第二條 cDNA 合成 （ 4）雙鏈 cDNA 克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖 ？技術(shù)原理是什么？它們各有什么優(yōu)點和缺點 ? 答：⑴差異顯示 PCR：根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA339。端具有的多聚腺苷酸尾（ polyA）結(jié)構(gòu)，可用含 oligo（ dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的 mRNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 優(yōu)點：速度快，操作簡單，靈敏度高而且樣品需要量少，一定程度上克服了差減雜交和扣除雜技技術(shù)的不足。 缺點：假陽性率高，獲得的 cDNA 片段很短，且其 3`末端含有非翻譯區(qū)，使基因分類或功能預(yù)測的難度增大。 ⑵ cDNA 代表性差異分析 優(yōu)點：假陽性低、特異性強(qiáng)、靈敏度高和重復(fù)性好 缺點：操作復(fù)雜、實驗周期長以及費用高 ⑶抑制性消減雜交 優(yōu)點：假陽性率低、靈敏度高、表達(dá)效率高、操作簡便。 缺點：只能用于兩組樣品對照處理，不能提供基因表達(dá)數(shù)量上的差異。 ⑷ RNA任意引物 PCR 原理：先從樣本中提 取總 RNA，用隨機(jī)引物合成 cDNA 的第一鏈，再用同樣或者不同的引物進(jìn)行 PCR 合成第二鏈，凝膠電泳可以顯示全部的 PCR 產(chǎn)物，再從中回收差異表達(dá)的基因片段，進(jìn)行克隆、測序。 優(yōu)點：有利于處理較短的 cDNA 片段。 缺點：假陽性率較高 ？ ①高效穩(wěn)定的再生能力 ②較高的遺傳穩(wěn)定性 ③具有穩(wěn)定的外植體來源 ④對選擇性抗菌素敏感 ⑤對農(nóng)桿菌侵染有敏感性 ： 答：真核生物基因工程包括植物基因工程、動物基因工程、微生物基因工程。 植物 基因工程的應(yīng)用： ㈠在植物遺傳改良中的應(yīng)用： ①植物對生物逆境性的抗性基因工程。 ②抗非生物性逆境基因工程。 ③植物抗除草劑基因工程。 ④作物高產(chǎn)基因工程。 ⑤資源利用效率的基因工程改良。 ⑥產(chǎn)物的延熟與保險。 ⑦品質(zhì)的改善。 ⑧雄性不育系的培育。 ⑨植物觀賞性狀遺傳改良。 ㈡作為藥物生產(chǎn)的反應(yīng)器。 1. 動物基因工程的應(yīng)用： ㈠提高動物的生產(chǎn)性能。 ㈡提高轉(zhuǎn)基因動物的抗病或抗性性能。 ㈢改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)。㈣基因治療。 2. 微生物基因工程的應(yīng)用： ㈠在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用（農(nóng)藥、肥料，飼料等）。 ㈡在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用（發(fā)酵工 業(yè)、食品添加劑、釀酒等）。 ㈢在藥物生產(chǎn)上的應(yīng)用（蛋白質(zhì)藥物、抗生素等）。 ㈣在環(huán)境保護(hù)上的應(yīng)用（農(nóng)藥殘留、石油產(chǎn)品、塑料等方面的降解 )。 ？請舉例說明。 1) 對人類健康的隱患：①潛在的致敏性；②非預(yù)期效應(yīng)；③轉(zhuǎn)基因食品基因水平轉(zhuǎn)移對健康的影響；④轉(zhuǎn)基因食品中重組 DNA 對健康的影響；⑤食品營養(yǎng)成分改變對人群營養(yǎng)的影響。 2