【正文】 第七章 食品微生物檢驗(yàn)學(xué)習(xí)本章的意義和內(nèi)容：掌握光學(xué)顯微鏡的使用方法，掌握細(xì)菌染色標(biāo)本的制作技術(shù)。掌握樣品的采集和處理方法。掌握菌落總數(shù)的測(cè)定方法與步驟。掌握大腸菌群的測(cè)定方法與步驟。學(xué)會(huì)乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)基的制備。掌握革蘭氏染色方法。本章習(xí)題內(nèi)容主要涉及：食品微生物檢驗(yàn)的范圍；食品微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)；細(xì)菌染色的基本方法和步驟；常用染色方法及染色液；食品微生物學(xué)一般檢驗(yàn)技術(shù)。一、食品微生物檢驗(yàn)的意義食品微生物檢驗(yàn)方法為食品監(jiān)測(cè)必不可少的重要組成部分。(1)它是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)之一。(2)通過(guò)食品微生物檢驗(yàn)，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生環(huán)境，能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度做出正確的評(píng)價(jià)，為各項(xiàng)衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù)，提供傳染病和人類(lèi)、動(dòng)物和食物中毒的防治措施。(3)食品微生物檢驗(yàn)是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康；同時(shí)，它對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟(jì)損失，保證出口等方面具有政治上和經(jīng)濟(jì)上的重要意義。 二、食品微生物檢驗(yàn)的范圍食品微生物檢驗(yàn)的范圍包括以下幾點(diǎn)：(1)生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)：車(chē)間用水、空氣、地面、墻壁等。(2)原輔料檢驗(yàn)：包括食用動(dòng)物、谷物、添加劑等一切原輔材料。(3)食品加工、儲(chǔ)藏、銷(xiāo)售諸環(huán)節(jié)的檢驗(yàn)：包括食品從業(yè)人員的衛(wèi)生狀況檢驗(yàn)、加工工具、運(yùn)輸車(chē)輛、包裝材料的檢驗(yàn)等。(4)食品的檢驗(yàn)：重要的是對(duì)出廠食品、可疑食品及食物中毒食品的檢驗(yàn)。 三、食品微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)我國(guó)衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。(1)菌落總數(shù)菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1g或1mL檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。(2)大腸菌群大腸菌群是寄居于人及溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的腸居菌，它隨著的大便排出體外。食品中如果大腸菌群數(shù)越多，說(shuō)明食品受糞便污染的程度越大。(3)致病菌致病菌即能夠引起人們發(fā)病的細(xì)菌。對(duì)不同的食品和不同的場(chǎng)合，應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn)。(4)霉菌及其毒素我國(guó)還沒(méi)有制定出霉菌的具體指標(biāo)，鑒于有很多霉菌能夠產(chǎn)生毒素，引起疾病，故應(yīng)該對(duì)產(chǎn)毒霉菌進(jìn)行檢驗(yàn)。(5)其它指標(biāo)微生物指標(biāo)還應(yīng)包括病毒，肝炎病毒、豬瘟病毒、雞新城疫病毒、馬立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，豬水泡病毒等；另外，從食品檢驗(yàn)的角度考慮，寄生蟲(chóng)也被很多學(xué)者列為微生物檢驗(yàn)的指標(biāo)。四、染色細(xì)菌標(biāo)本檢查法微生物中細(xì)菌、致病菌是很小的生物體，必須通過(guò)染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過(guò)染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長(zhǎng)有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。染料 細(xì)菌染色用的染料多為有色澤的有機(jī)酸或者有機(jī)堿，因?yàn)槠淙芙舛扔邢蓿话闶褂闷潲}類(lèi)。 可分為以下四類(lèi)。 (一)酸性染料 染色離子帶陰電，因此，又叫做陰離子染料。它能與帶陽(yáng)電的物質(zhì)結(jié)合，使之著色。降低菌液的pH而使細(xì)菌帶陽(yáng)電時(shí)，就可用酸性染料染色。如伊紅、剛果紅等。 (二)堿性染料 染料離子帶正電，也叫做陽(yáng)離子染料。它能與帶負(fù)電的物質(zhì)結(jié)合。細(xì)菌一般帶負(fù)電，所以細(xì)菌染色所用的染料，常用堿性染料，如美藍(lán)、堿性復(fù)紅等。一部分堿性染料，如堿性復(fù)紅、美藍(lán)等具有與氫結(jié)合的能力，結(jié)合后雙鍵飽和，色基不再存在。此時(shí)，化合韌杖還原，成為無(wú)色的化合物，再經(jīng)氧化即可顯色。 (三)復(fù)合染料 堿性染料與酸性染料的結(jié)合物，叫做復(fù)合染料，或叫中性染料。例如wright染料中的伊紅美藍(lán)，Giemsa染料中的伊紅天青等。 (四)單純?nèi)玖媳蝗菊绕馕锷甥}類(lèi)。它的染色能力，視其能否溶于被染物而言。它們大多數(shù)屬于偶氮化合物，具有脂溶性而不溶于水，如蘇丹類(lèi)(Sudans)染料。影響染色的因素不同細(xì)菌其細(xì)胞壁酌結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性，膜孔的大小等有一定的羌別，用染料對(duì)其染色時(shí)．可能會(huì)有不同的結(jié)果。此外，培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中電解質(zhì)含雖和pH、溫度、藥物等，都可能影響細(xì)的染色情況。細(xì)菌染色的基本方法和步驟 單染色法是用一種染料染色的方法。例如用美藍(lán)或稀釋擊炭酸復(fù)紅等，使各種細(xì)菌染成間—種顏色。故此法只顯小細(xì)菌的形態(tài)和大小，對(duì)細(xì)菌鑒別價(jià)值較小。在染色過(guò)程中常加入媒染劑如碘、石炭酸、明礬或者加熱的方法，以增加染料對(duì)細(xì)菌的親和力。 復(fù)染色法是用兩種以上染料染色的方法，此法除顯示細(xì)菌形態(tài)大小外，不同類(lèi)型的細(xì)菌可以染上不同的顏色，從而具合鑒別細(xì)菌種類(lèi)的價(jià)值，因此也稱(chēng)鑒別染色法。用復(fù)染色法染色時(shí)，所用的脫色劑如酒精、丙酮或酸類(lèi)，用于檢查染料和細(xì)菌結(jié)合的牢固程度，最后用與初染色劑顏色有鮮明對(duì)比的染料進(jìn)行復(fù)染，以便進(jìn)行觀察，區(qū)別細(xì)菌種類(lèi)。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸染色。 檢查細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，如鞭毛、英膜、異染顆粒等對(duì)鑒別細(xì)菌很有幫助。細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)染色法不僅能使特殊的結(jié)構(gòu)著色，還可使特殊結(jié)構(gòu)染成與菌體不同的顏色，有利于觀察。在細(xì)菌檢查工作中，除異染顆粒染色法較常應(yīng)用外，其他持殊結(jié)構(gòu)染色法操作費(fèi)時(shí)，且可用其他簡(jiǎn)易方法代替，故在日常檢驗(yàn)工作中較少使用。 熒光染料，如金膠等也可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色。此類(lèi)染料溶于水中，在紫外線(xiàn)照射下能激發(fā)出熒光，分為酸性染料及堿性染料兩種。細(xì)菌用熒光染料染色后在熒光顯微鏡下檢查，可在黑的背景中觀察到細(xì)菌發(fā)出明亮的熒光。用熒光染色法檢查細(xì)菌可加快檢查速度和提高陽(yáng)性率。用熒光光源和普通光學(xué)顯微鏡配合起來(lái)，即可代替熒光顯微鏡進(jìn)行熒光染色法檢查。 涂片－干燥一固定一染色－媒染一脫色－復(fù)染－鏡檢 單染法不需要媒染一脫色－復(fù)染步驟。染色過(guò)的細(xì)菌涂片標(biāo)本在鏡檢時(shí)一般使用油浸鏡。如果需保存標(biāo)本，可在鏡檢后，用拭鏡紙沾二甲苯擦掉鏡油。長(zhǎng)期保存在標(biāo)本中央滴加一滴加拿大樹(shù)膠，蓋上一潔凈的蓋玻片，待其自然干燥后，保存于玻片標(biāo)本盒中。常用染色方法及染色液美藍(lán) 95％乙醇 30mL％氫氧化鉀溶液 100mL將美藍(lán)溶解于乙醇中，然后于氫氧化鉀溶液混合。將涂片在火焰上固定，待冷卻后滴加染液，染1min～3min，水洗，待干，鏡檢。菌體呈藍(lán)色。 革蘭氏染色法(1) 結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫 1g95％乙醇 20mL1％草酸銨水溶液 80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。(2)革蘭氏碘液碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，在加蒸餾水至300mL。(3)沙黃復(fù)染法沙黃 95％乙醇 10mL蒸餾水 90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。(1)將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。(2)滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。(3)滴加95％乙醇脫色，約30s；或?qū)⒁掖嫉螡M(mǎn)整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿(mǎn)整個(gè)涂片，脫色10s。(4)水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：亦可用1：10稀釋石炭酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時(shí)間僅需10s。（萎—倪二氏法）(1)石炭酸品紅染色液堿性品紅 95％乙醇 10mL5％苯酚水溶液 90mL將品紅溶解于乙醇中，然后與苯酚溶液混合。(2)3％鹽酸乙醇濃煙酸 3mL95％乙醇 97mL(3)復(fù)染液呂氏堿性美藍(lán)染色液(1)將涂片在火焰上固定，滴加石炭酸品紅染色液，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，但切不可使沸騰。染液因蒸發(fā)減少時(shí)，應(yīng)隨時(shí)添加。染5min，傾去染液，水洗。(2)滴加鹽酸乙醇脫色，直至無(wú)紅色