【正文】 第七講 原核生物的基因調(diào)控科學家把這個從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(gene expression)，對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達調(diào)控(gene regulation或gene control)。要了解動、植物生長發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表達調(diào)控的時間和空間概念，掌握了基因表達調(diào)控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學奧妙的金鑰匙。 基因表達調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個方面：① 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulation)；② mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)；③ 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA).原核生物中，營養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmental factor)對基因表達起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達調(diào)控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。 二、基因表達調(diào)控的基本原理　　（一）基因表達的多級調(diào)控　　基因的結(jié)構(gòu)活化、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運、mRNA降解、翻譯及翻譯后加工及蛋白質(zhì)降解等均為基因表達調(diào)控的控制點?？梢?，基因表達調(diào)控是在多級水平上進行的復雜事件。其中轉(zhuǎn)錄起始是基因表達的基本控制點?！　∷膫€基本的調(diào)控點：　?。?）基因結(jié)構(gòu)的活化。DNA暴露堿基后RNA聚合酶才能有效結(jié)合?；罨癄顟B(tài)的基因表現(xiàn)為：；；?！　。?）轉(zhuǎn)錄起始。最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，通過DNA元件與調(diào)控蛋白相互作用來調(diào)控基因表達?！　。?）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運。RNA編輯、剪接、轉(zhuǎn)運?！　。?）翻譯及翻譯后加工。翻譯水平可通過特異的蛋白因子阻斷mRNA翻譯翻譯后對蛋白的加工、修飾也是基本調(diào)控環(huán)節(jié)。（二）基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素　　1．DNA序列　　原核生物大多數(shù)基因表達調(diào)控是通過操縱子機制實現(xiàn)的。操縱子通常由 2個以上的編碼序列與啟動序列、操縱序列以及其他調(diào)節(jié)序列在基因組中成簇串聯(lián)組成。啟動序列是RNA聚合酶結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。多種原核基因啟動序列特定區(qū)域內(nèi)，通常在轉(zhuǎn)錄起始點上游10及35區(qū)域存在一些相似序列，稱為共有序列。大腸桿菌及一些細菌啟動序列的共有序列在10區(qū)域是TATAAT，又稱Pribnow盒（PribnowBox），在35區(qū)域為 TTGACA。這些共有序列中的任一堿基突變或變異都會影響RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始。因此，共有序列決定啟動序列的轉(zhuǎn)錄活性大小。操縱序列是原核阻遏蛋白的結(jié)合位點。當操縱序列結(jié)合阻遏蛋白時會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移動，阻遏轉(zhuǎn)錄，介導負性調(diào)節(jié)。原核操縱子調(diào)節(jié)序列中還有一種特異DNA序列可結(jié)合激活蛋白，使轉(zhuǎn)錄激活，介導正性調(diào)節(jié)。　　順式作用元件就是指可影響自身基因表達活性的 DNA序列。在不同真核基因的順式作用元件中會時常發(fā)現(xiàn)一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。這些共有序列就是順式作用元件的核心序列，它們是真核RNA聚合酶或特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。順式作用元件通常是非編碼序列。順式作用元件并非都位于轉(zhuǎn)錄起點上游（5′端）。根據(jù)順式作用元件在基因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，可將真核基因的這些功能元件分為啟動子、增強子及沉默子等?！　?．調(diào)節(jié)蛋白　　原核調(diào)節(jié)蛋白分為三類：特異因子、阻遏蛋白和激活蛋白。特異因子決定RNA聚合酶對一個或一套啟動序列的特異性識別和結(jié)合能力。阻遏蛋白可結(jié)合操縱序列，阻遏基因轉(zhuǎn)錄。激活蛋白可結(jié)合啟動序列鄰近的DNA序列，促進RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，增強RNA聚合酶活性?！　≌婧苏{(diào)節(jié)蛋白又稱轉(zhuǎn)錄因子。絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達后，通過與特異的順式作用元件相互作用（DNA蛋白質(zhì)相互作用）反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用因子。有些基因產(chǎn)物可特異識別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開啟或關閉，這就是順式作用。具有這種調(diào)節(jié)方式的調(diào)節(jié)蛋白稱為順式作用蛋白?！　?．DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用　　DNA蛋白質(zhì)相互作用指反式作用因子與順式作用元件之間的特異識別及結(jié)合。這種結(jié)合通常是非共價結(jié)合。　　絕大多數(shù)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合 DNA前需通過蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體或多聚體。所謂二聚化就是指兩分子單體通過一定的結(jié)構(gòu)域結(jié)合成二聚體，它是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA時最常見的形式。由同種分子形成的二聚體稱同二聚體，異種分子間形成的二聚體稱異二聚體。除二聚化或多聚化反應，還有一些調(diào)節(jié)蛋白不能直接結(jié)合DNA，而是通過蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用間接結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。　　4．RNA聚合酶　　DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)最終是由RNA聚合酶活性體現(xiàn)的。啟動序列／啟動子的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白性質(zhì)對RNA聚合酶活性影響很大。　　(1)啟動序列或啟動子與RNA聚合酶活性：原核啟動序列或真核啟動子是由轉(zhuǎn)錄起始點、RNA聚合酶結(jié)合位點及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。會影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起始頻率。　?。?）調(diào)節(jié)蛋白與RNA聚合酶活性：一些特異調(diào)節(jié)蛋白在適當環(huán)境信號刺激下在細胞內(nèi)表達，隨后這些調(diào)節(jié)蛋白通過DNA蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性，從而使基礎轉(zhuǎn)錄頻率發(fā)生改變，出現(xiàn)表達水平變化。三、原核基因表達調(diào)控原核生物的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，根據(jù)調(diào)節(jié)機制的不同分為負轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在負調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)作用特征又可分為負誘導作用和負阻遏作用。在負誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應物（誘導物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。在正控誘導系統(tǒng)中，誘導物的存在使激活蛋白處于活性蛋白；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應物分子的存在是激活蛋白處于非活性狀態(tài)。（一）原核基因調(diào)節(jié)特點σ因子決定mRNA識別特異性 原核生物細胞僅含有一種RNA聚合酶，核心酶參與轉(zhuǎn)錄延長，全酶司轉(zhuǎn)錄起始。在轉(zhuǎn)錄起始階段，σ亞基（又稱σ因子）識別特異啟動序列；不同的σ因子決定特異基因的轉(zhuǎn)錄激活，決定tRNA、mRNA和rRNA基因的轉(zhuǎn)錄。（二）乳糖操縱子調(diào)節(jié)機制1乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)細菌能隨環(huán)境的變化，迅速改變某些基因表達的狀態(tài)，這就是很好的基因表達調(diào)控的實驗型。人們就是從研究這種現(xiàn)象開始，打開認識基因表達調(diào)控分子機理的窗口的。大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而生長繁殖。當培養(yǎng)基中有葡萄糖和乳糖時，細菌優(yōu)先使用葡萄糖，當葡萄糖耗盡，細菌停止生長，經(jīng)過短時間的適應，就能利用乳糖，細菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長(圖19－1)。說明酶可以誘導。在不含乳糖及β半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型每個大腸桿功細胞內(nèi)大約只有12個酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達到細胞總蛋白量的6%或7%，每個細胞中可有超過105個酶分子。當有乳糖供應時，在無葡萄糖培養(yǎng)基中生長的lac+細菌中將同時合成β半乳糖苷酶和透過酶，如圖。用32P標記，結(jié)果表明培養(yǎng)基中加入乳糖12min后，編碼β半乳糖苷酶和透過酶的lac mRNA量就迅速增加。去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降到幾乎無法檢測到，表明乳糖確實能激發(fā)lac RNA的合成。事實上，研究誘導作用時很少使用乳糖，因為培養(yǎng)基中的乳糖會被誘導合成的β半乳糖苷酶所催化降解，從而使其濃度不斷發(fā)生變化。實驗中通常使用乳糖類似物：異丙基硫基半乳糖苷（IPTG）、琉甲基半乳糖苷（TMC）和O硝基半乳糖苷（ONPG）。它們都是高效誘導物，因為它們都不是半乳糖苷酶的底物，所以又稱為安慰性誘導物（gratuitous inducer）。為了證明誘導物的作用是誘導新合成酶而不是將已存在于細胞中的酶前體物轉(zhuǎn)化成有活性的酶，把大腸桿菌細胞放在加有放射性35S標記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導物的培養(yǎng)基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細菌轉(zhuǎn)移到不含35S、無放射性的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中誘導物的加入，β半乳糖苷酶便開始合成。分離β半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標記。說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導物后新合成的。操縱子模型的提出 —莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)獲1965年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎1940年， Monod發(fā)現(xiàn)：細菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時，細菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。1947年，報告：“酶的適應現(xiàn)象及其在細胞分化中的意義”。1951年，Monod與Jacob合作。發(fā)現(xiàn)兩對基因：Z基因：與合成β半乳糖苷酶有關；I基因：決定細胞對誘導物的反應。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當阻遏物存在時，酶無法合成，只有有誘導物存在，才能去掉該阻遏物。Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關基因（即操縱基因），阻遏物通過與開關基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達。2結(jié)構(gòu)大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β半乳糖苷酶、透酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)節(jié)基因Ⅰ。Ⅰ基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達。A PO區(qū)P區(qū)是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄開始點為止，而O區(qū)的范圍是抑制物結(jié)合區(qū)。mRNA是從第85對堿基開始的，所以P區(qū)共84個堿基，抑制物結(jié)合區(qū)從78－112，共35對堿基，和P區(qū)有7個堿基的重復。使這段序列可能無法同時結(jié)合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能雖然可以同時結(jié)合，但無法形成開放的轉(zhuǎn)錄起始復合物。PO區(qū)堿基對的命序，是從mRNA起始的第一個核苷酸為＋1與轉(zhuǎn)錄方向一致的為正，與轉(zhuǎn)錄方向相反的為負。所以P區(qū)從－84到－1，抑制物保護區(qū)是－7到28。B阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)　　當大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時，1ac操縱元處于阻遏狀態(tài)。i基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成性表達產(chǎn)生阻遏蛋白R，每個細胞中僅維持約10個分子的阻遏蛋白。R以四聚體形式與操縱子O結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子P1ac的結(jié)合，阻止了基因的轉(zhuǎn)錄起動。R的阻遏作用不是絕對的，R與O偶爾解離，使細胞中還有極低水平的β－半乳糖苷酶及透過酶的生成。當有乳糖存在時，乳糖受β－半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，R四聚體解聚成單體，失去與O的親和力，與O解離，基因轉(zhuǎn)錄開放，β－半乳糖苷酶在細胞內(nèi)的含量可增加1000倍。這就是乳糖對1ac操縱元的誘導作用。一些化學合成的乳糖類似物，不受β－半乳糖苷酶的催化分解，卻也能與R特異性結(jié)合，使R構(gòu)象變化，誘導1ac操縱元的開放。例如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)就是很強的誘導劑，不被細胞代謝而十分穩(wěn)定。X－gal(5－溴－4－氯－3－吲哚－β－半乳糖苷)也是一種人工化學合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物，因此可以用作β－半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X_gal都被廣泛應用在分子生物學和基因工程的工作中。　　　　細菌中的cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關，當細菌利用葡萄糖分解供給能量時，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，當環(huán)境中無葡萄糖可供利用時，cAMP含量就升高。細菌中有一種能與cAMP特異結(jié)合的cAMP受體蛋白CRP(cAMP receptor protein)，當CRP未與cAMP結(jié)合時它是沒有活性的，當cAMP濃度升高時，CRP與cAMP結(jié)合并發(fā)生空間構(gòu)象的變化而