【正文】 第七講 原核生物的基因調(diào)控科學(xué)家把這個(gè)從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)(gene expression)，對這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控(gene regulation或gene control)。要了解動、植物生長發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，就必須弄清楚基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。 基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：① 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulation)；② mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcript)；③ 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA).原核生物中，營養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmental factor)對基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。 二、基因表達(dá)調(diào)控的基本原理　?。ㄒ唬┗虮磉_(dá)的多級調(diào)控　　基因的結(jié)構(gòu)活化、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA降解、翻譯及翻譯后加工及蛋白質(zhì)降解等均為基因表達(dá)調(diào)控的控制點(diǎn)?？梢姡虮磉_(dá)調(diào)控是在多級水平上進(jìn)行的復(fù)雜事件。其中轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)的基本控制點(diǎn)。　　四個(gè)基本的調(diào)控點(diǎn)：　?。?）基因結(jié)構(gòu)的活化。DNA暴露堿基后RNA聚合酶才能有效結(jié)合?；罨癄顟B(tài)的基因表現(xiàn)為：；；。　?。?）轉(zhuǎn)錄起始。最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，通過DNA元件與調(diào)控蛋白相互作用來調(diào)控基因表達(dá)?！　。?）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運(yùn)。RNA編輯、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)?！　。?）翻譯及翻譯后加工。翻譯水平可通過特異的蛋白因子阻斷mRNA翻譯翻譯后對蛋白的加工、修飾也是基本調(diào)控環(huán)節(jié)。（二）基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素　　1．DNA序列　　原核生物大多數(shù)基因表達(dá)調(diào)控是通過操縱子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。操縱子通常由 2個(gè)以上的編碼序列與啟動序列、操縱序列以及其他調(diào)節(jié)序列在基因組中成簇串聯(lián)組成。啟動序列是RNA聚合酶結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。多種原核基因啟動序列特定區(qū)域內(nèi)，通常在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游10及35區(qū)域存在一些相似序列，稱為共有序列。大腸桿菌及一些細(xì)菌啟動序列的共有序列在10區(qū)域是TATAAT，又稱Pribnow盒（PribnowBox），在35區(qū)域?yàn)?TTGACA。這些共有序列中的任一堿基突變或變異都會影響RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始。因此，共有序列決定啟動序列的轉(zhuǎn)錄活性大小。操縱序列是原核阻遏蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)操縱序列結(jié)合阻遏蛋白時(shí)會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移動，阻遏轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)。原核操縱子調(diào)節(jié)序列中還有一種特異DNA序列可結(jié)合激活蛋白，使轉(zhuǎn)錄激活，介導(dǎo)正性調(diào)節(jié)?！　№樖阶饔迷褪侵缚捎绊懽陨砘虮磉_(dá)活性的 DNA序列。在不同真核基因的順式作用元件中會時(shí)常發(fā)現(xiàn)一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。這些共有序列就是順式作用元件的核心序列，它們是真核RNA聚合酶或特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。順式作用元件通常是非編碼序列。順式作用元件并非都位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游（5′端）。根據(jù)順式作用元件在基因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，可將真核基因的這些功能元件分為啟動子、增強(qiáng)子及沉默子等?！　?．調(diào)節(jié)蛋白　　原核調(diào)節(jié)蛋白分為三類：特異因子、阻遏蛋白和激活蛋白。特異因子決定RNA聚合酶對一個(gè)或一套啟動序列的特異性識別和結(jié)合能力。阻遏蛋白可結(jié)合操縱序列，阻遏基因轉(zhuǎn)錄。激活蛋白可結(jié)合啟動序列鄰近的DNA序列，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合酶活性?！　≌婧苏{(diào)節(jié)蛋白又稱轉(zhuǎn)錄因子。絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，通過與特異的順式作用元件相互作用（DNA蛋白質(zhì)相互作用）反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用因子。有些基因產(chǎn)物可特異識別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開啟或關(guān)閉，這就是順式作用。具有這種調(diào)節(jié)方式的調(diào)節(jié)蛋白稱為順式作用蛋白?！　?．DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用　　DNA蛋白質(zhì)相互作用指反式作用因子與順式作用元件之間的特異識別及結(jié)合。這種結(jié)合通常是非共價(jià)結(jié)合?！　〗^大多數(shù)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合 DNA前需通過蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體或多聚體。所謂二聚化就是指兩分子單體通過一定的結(jié)構(gòu)域結(jié)合成二聚體，它是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA時(shí)最常見的形式。由同種分子形成的二聚體稱同二聚體，異種分子間形成的二聚體稱異二聚體。除二聚化或多聚化反應(yīng)，還有一些調(diào)節(jié)蛋白不能直接結(jié)合DNA，而是通過蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用間接結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄?！　?．RNA聚合酶　　DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)最終是由RNA聚合酶活性體現(xiàn)的。啟動序列／啟動子的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)蛋白性質(zhì)對RNA聚合酶活性影響很大?！　?1)啟動序列或啟動子與RNA聚合酶活性：原核啟動序列或真核啟動子是由轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。會影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起始頻率?！　。?）調(diào)節(jié)蛋白與RNA聚合酶活性：一些特異調(diào)節(jié)蛋白在適當(dāng)環(huán)境信號刺激下在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，隨后這些調(diào)節(jié)蛋白通過DNA蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性，從而使基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄頻率發(fā)生改變，出現(xiàn)表達(dá)水平變化。三、原核基因表達(dá)調(diào)控原核生物的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，根據(jù)調(diào)節(jié)機(jī)制的不同分為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在負(fù)調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的作用。根據(jù)作用特征又可分為負(fù)誘導(dǎo)作用和負(fù)阻遏作用。在負(fù)誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄；在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。在正轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中，調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）。在正控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)物的存在使激活蛋白處于活性蛋白；在正控阻遏系統(tǒng)中，效應(yīng)物分子的存在是激活蛋白處于非活性狀態(tài)。（一）原核基因調(diào)節(jié)特點(diǎn)σ因子決定mRNA識別特異性 原核生物細(xì)胞僅含有一種RNA聚合酶，核心酶參與轉(zhuǎn)錄延長，全酶司轉(zhuǎn)錄起始。在轉(zhuǎn)錄起始階段，σ亞基（又稱σ因子）識別特異啟動序列；不同的σ因子決定特異基因的轉(zhuǎn)錄激活，決定tRNA、mRNA和rRNA基因的轉(zhuǎn)錄。（二）乳糖操縱子調(diào)節(jié)機(jī)制1乳糖操縱子的發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能隨環(huán)境的變化，迅速改變某些基因表達(dá)的狀態(tài)，這就是很好的基因表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)型。人們就是從研究這種現(xiàn)象開始，打開認(rèn)識基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理的窗口的。大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而生長繁殖。當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖和乳糖時(shí)，細(xì)菌優(yōu)先使用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖耗盡，細(xì)菌停止生長，經(jīng)過短時(shí)間的適應(yīng)，就能利用乳糖，細(xì)菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長(圖19－1)。說明酶可以誘導(dǎo)。在不含乳糖及β半乳糖苷的培養(yǎng)基中，lac+基因型每個(gè)大腸桿功細(xì)胞內(nèi)大約只有12個(gè)酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，每個(gè)細(xì)胞中可有超過105個(gè)酶分子。當(dāng)有乳糖供應(yīng)時(shí)，在無葡萄糖培養(yǎng)基中生長的lac+細(xì)菌中將同時(shí)合成β半乳糖苷酶和透過酶，如圖。用32P標(biāo)記，結(jié)果表明培養(yǎng)基中加入乳糖12min后，編碼β半乳糖苷酶和透過酶的lac mRNA量就迅速增加。去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降到幾乎無法檢測到，表明乳糖確實(shí)能激發(fā)lac RNA的合成。事實(shí)上，研究誘導(dǎo)作用時(shí)很少使用乳糖，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的乳糖會被誘導(dǎo)合成的β半乳糖苷酶所催化降解，從而使其濃度不斷發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)中通常使用乳糖類似物：異丙基硫基半乳糖苷（IPTG）、琉甲基半乳糖苷（TMC）和O硝基半乳糖苷（ONPG）。它們都是高效誘導(dǎo)物，因?yàn)樗鼈兌疾皇前肴樘擒彰傅牡孜?，所以又稱為安慰性誘導(dǎo)物（gratuitous inducer）。為了證明誘導(dǎo)物的作用是誘導(dǎo)新合成酶而不是將已存在于細(xì)胞中的酶前體物轉(zhuǎn)化成有活性的酶，把大腸桿菌細(xì)胞放在加有放射性35S標(biāo)記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S、無放射性的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的加入，β半乳糖苷酶便開始合成。分離β半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標(biāo)記。說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。操縱子模型的提出 —莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1940年， Monod發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時(shí)，細(xì)菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細(xì)菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。1947年，報(bào)告：“酶的適應(yīng)現(xiàn)象及其在細(xì)胞分化中的意義”。1951年，Monod與Jacob合作。發(fā)現(xiàn)兩對基因：Z基因：與合成β半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細(xì)胞對誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當(dāng)阻遏物存在時(shí)，酶無法合成，只有有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（即操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。2結(jié)構(gòu)大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因Ⅰ。Ⅰ基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點(diǎn)，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。A PO區(qū)P區(qū)是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄開始點(diǎn)為止，而O區(qū)的范圍是抑制物結(jié)合區(qū)。mRNA是從第85對堿基開始的，所以P區(qū)共84個(gè)堿基，抑制物結(jié)合區(qū)從78－112，共35對堿基，和P區(qū)有7個(gè)堿基的重復(fù)。使這段序列可能無法同時(shí)結(jié)合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能雖然可以同時(shí)結(jié)合，但無法形成開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。PO區(qū)堿基對的命序，是從mRNA起始的第一個(gè)核苷酸為＋1與轉(zhuǎn)錄方向一致的為正，與轉(zhuǎn)錄方向相反的為負(fù)。所以P區(qū)從－84到－1，抑制物保護(hù)區(qū)是－7到28。B阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)　　當(dāng)大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時(shí)，1ac操縱元處于阻遏狀態(tài)。i基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成性表達(dá)產(chǎn)生阻遏蛋白R，每個(gè)細(xì)胞中僅維持約10個(gè)分子的阻遏蛋白。R以四聚體形式與操縱子O結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子P1ac的結(jié)合，阻止了基因的轉(zhuǎn)錄起動。R的阻遏作用不是絕對的，R與O偶爾解離，使細(xì)胞中還有極低水平的β－半乳糖苷酶及透過酶的生成。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，乳糖受β－半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，R四聚體解聚成單體，失去與O的親和力，與O解離，基因轉(zhuǎn)錄開放，β－半乳糖苷酶在細(xì)胞內(nèi)的含量可增加1000倍。這就是乳糖對1ac操縱元的誘導(dǎo)作用。一些化學(xué)合成的乳糖類似物，不受β－半乳糖苷酶的催化分解，卻也能與R特異性結(jié)合，使R構(gòu)象變化，誘導(dǎo)1ac操縱元的開放。例如異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)就是很強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)胞代謝而十分穩(wěn)定。X－gal(5－溴－4－氯－3－吲哚－β－半乳糖苷)也是一種人工化學(xué)合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解產(chǎn)生蘭色化合物，因此可以用作β－半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG和X_gal都被廣泛應(yīng)用在分子生物學(xué)和基因工程的工作中。　　　　細(xì)菌中的cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關(guān)，當(dāng)細(xì)菌利用葡萄糖分解供給能量時(shí)，cAMP生成少而分解多，cAMP含量低；相反，當(dāng)環(huán)境中無葡萄糖可供利用時(shí)，cAMP含量就升高。細(xì)菌中有一種能與cAMP特異結(jié)合的cAMP受體蛋白CRP(cAMP receptor protein)，當(dāng)CRP未與cAMP結(jié)合時(shí)它是沒有活性的，當(dāng)cAMP濃度升高時(shí)，CRP與cAMP結(jié)合并發(fā)生空間構(gòu)象的變化而