【正文】 第八講 真核生物的基因調(diào)控一、真核生物的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)① 在真核細(xì)胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，不存在原核生物中常見(jiàn)的多基因操縱子形式。② 真核細(xì)胞DNA都與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA是裸露的。③ 高等真核細(xì)胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細(xì)胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。④ 真核生物能夠有序地根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育階段的需要進(jìn)行DNA片段重排，還能在需要時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。⑤ 在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對(duì)較大，它們可能遠(yuǎn)離啟動(dòng)子達(dá)幾百個(gè)甚至上千個(gè)堿基對(duì)，這些調(diào)節(jié)區(qū)一般通過(guò)改變整個(gè)所控制基因539。上游區(qū)DNA構(gòu)型來(lái)影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力。在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動(dòng)子上游不遠(yuǎn)處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點(diǎn)上可直接促進(jìn)或抑RNA聚合酶與它的結(jié)合。⑥ 真核生物的RNA在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔。⑦ 許多真核生物的基因只有經(jīng)過(guò)復(fù)雜的成熟和剪接過(guò)程（maturation and splicing），才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)。二、真核生物的轉(zhuǎn)錄特點(diǎn) 原核生物中，密切相關(guān)的基因往往組成操縱子，并且以多順?lè)醋觤RNA的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，整個(gè)體系置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下。真核生物的DNA是單順?lè)醋?，很少有置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制之下的操縱子。真核生物中許多相關(guān)的基因按功能成套組合，被稱為基因家族（gene family）?；蚣易逡唤M功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因?？赡苡赡骋还餐嫦然?ancestral gene)經(jīng)重復(fù)(duplication)和突變產(chǎn)生。 基因家族的特點(diǎn)： ①基因家族的成員可以串聯(lián)排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串聯(lián)重復(fù)基因(tandemly repeated genes)，它們可同時(shí)發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)，如rRNA、tRNA和組蛋白的基因； ②有些基因家族的成員也可位于不同的染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因； ③有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這種基因稱為假基因 (Pseudogene)。假基因與有功能的基因同源，原來(lái)可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點(diǎn)突變等，使這一基因失去活性，成為無(wú)功能基因。與相應(yīng)的正常基因相比，假基因往往缺少正?；虻膬?nèi)含子，兩側(cè)有順向重復(fù)序列。人們推測(cè)，假基因的來(lái)源之一，可能是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后生成的RNA前體通過(guò)剪接失去內(nèi)含子形成mRNA，如果mRNA經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，再整合到染色體DNA中去，便有可能成為假基因，因此該假基因是沒(méi)有內(nèi)含子的，在這個(gè)過(guò)程中，可能同時(shí)會(huì)發(fā)生缺失，倒位或點(diǎn)突變等變化，從而使假基因不能表達(dá)。 1） 簡(jiǎn)單基因家族2） 復(fù)雜基因家族海膽，5個(gè)基因組成串聯(lián)單位，可以重復(fù)1000次。串聯(lián)單位中的每個(gè)基因分別被轉(zhuǎn)錄成單順?lè)醋覴NA，這些RNA都沒(méi)有內(nèi)含子，而且各基因在同一條DNA鏈上按同一方向轉(zhuǎn)錄，每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯速度都受到調(diào)節(jié)。3） 發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜基因家族在生物個(gè)體不同發(fā)育階段，出現(xiàn)幾種不同形式的α和β亞基。人的α－珠蛋白基因簇位于16號(hào)染色體短臂上，其中ζ為胚胎期基因；β－珠蛋白基因簇位于11號(hào)染色體短臂上，其中ε為胚胎期基因，Gγ和Aγ為胎兒型基因，δ和β為成人期基因。在每個(gè)基因家族中，基因排列的順序就是它們?cè)诎l(fā)育階段的表達(dá)順序。原始珠蛋白大約產(chǎn)生于8億年前，由單基因編碼，現(xiàn)代珠蛋白基因家族是由同一個(gè)原始基因通過(guò)一系列重復(fù)、突變和轉(zhuǎn)位演變而成的。隨著物種的進(jìn)化，動(dòng)物的體積相對(duì)變大，對(duì)氧的需求量越來(lái)越大，在進(jìn)化壓力下，血紅蛋白基因通過(guò)自發(fā)突變產(chǎn)生雜合基因，編碼出對(duì)氧的結(jié)合和釋放能力要大大高于單分子血紅蛋白的四聚體。在哺乳動(dòng)物的進(jìn)化中，β鏈基因又發(fā)生突變和重復(fù)，形成了胎兒中的ε和γ型珠蛋白。胎兒血紅蛋白對(duì)氧的親和力比成人更大，因而利于胎兒得快速發(fā)育。4） 假基因 1977年，GJacp在對(duì)非洲爪贍5SrRNA基因簇的研究后提出了假基因的概念，這是一種核苷酸序列同其相應(yīng)的正常功能基因基本相同，但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。假基因的發(fā)現(xiàn)是真核生物應(yīng)用重組DNA技術(shù)和序列分析的結(jié)果。現(xiàn)已在大多數(shù)真核生物中發(fā)現(xiàn)了假基因，如Hb的假基因、干擾素、組蛋白、α球蛋白和β球蛋白、肌動(dòng)蛋白及人的rRNA和tRNA基因均含有假基因。由于假基因不工作或無(wú)效工作，故有人認(rèn)為假基因，相當(dāng)人的痕跡器官，或作為后補(bǔ)基因。 除了多種多樣的遺傳缺陷外，大多數(shù)返座假基因具有以下4個(gè)較鮮明的特征：a) 完全缺失存在于功能基因中的間隔序列，即內(nèi)含子序列；b) 假基因的序列只與功能基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的起點(diǎn)和終點(diǎn)之間的序列相似，而與其5’端調(diào)控序列無(wú)關(guān)。但是鼠Ψα3珠蛋白假基因［7］，鼠促皮質(zhì)素β脂蛋白前體假基因［8］、人免疫球蛋白ε及λΨ1假基因［9，10］是其中的例外；c) 假基因的3’末端緊接著有多聚腺嘌呤尾。以上3個(gè)特征明顯提示這些序列是從成熟mRNA衍生而來(lái)，因此這類假基因又被稱為處理后的假基因(圖1)。d) 這類假基因的序列兩端常被7～21bp的正向重復(fù)序列包圍。這種正向重復(fù)序列也在snRNA假基因家族和AluⅠ家族中被發(fā)現(xiàn)，提示正向重復(fù)序列的產(chǎn)生可能是一種共同的插入機(jī)制的結(jié)果。通過(guò)分析基因組序列發(fā)現(xiàn)，基因組中存在著與基因數(shù)量幾乎相等的假基因，假基因是功能基因的缺陷拷貝。在過(guò)去的幾十年中，假基因一直被認(rèn)為是分子化石，是進(jìn)化中基因突變的遺跡。而2003年5月日本學(xué)者Hirotsune的報(bào)導(dǎo)第一次揭示了假基因的功能。 Hirotsune等人將果蠅的sex－lethal基因轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，大多數(shù)小鼠表現(xiàn)正常，但有一個(gè)品系的小鼠在幼年期全部死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，sex－lethal基因插入到makorin1－p1假基因中部，破壞了該假基因的轉(zhuǎn)錄。makorin1－p1是makorin1基因的假基因。如果將假基因makorin1－p1敲除，makorin1基因?qū)⒈魂P(guān)閉。這說(shuō)明，基因makorin1的表達(dá)受到其同源序列假基因的控制。DNA水平調(diào)控1）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞分裂時(shí)染色體的大部分到間期時(shí)松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)（euchromatin），染色質(zhì)常常會(huì)在特定的區(qū)域被解旋松弛，形成自由的DNA，DNA本身局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因暴露，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)區(qū)DNA的結(jié)合，誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄。松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)（hetrochromatin），其中從未見(jiàn)有基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。原本在常染色質(zhì)中表達(dá)的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會(huì)停止表達(dá)；哺乳類雌體細(xì)胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活?？梢?jiàn)緊密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達(dá)。 常染色質(zhì)(euchromatin) ：指間期核內(nèi)染色質(zhì)纖維折疊壓縮程度低, 處于伸展?fàn)顟B(tài)（典型包裝率750倍）, 用堿性染料染色時(shí)著色淺的那些染色質(zhì)。常染色質(zhì)是進(jìn)行活躍轉(zhuǎn)錄的部位，呈疏松的環(huán)狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染。并非所有基因都具有轉(zhuǎn)錄活性,常染色質(zhì)狀態(tài)只是基因轉(zhuǎn)錄的必要條件而非充分條件 異染色質(zhì)(heterochromatin)：指間期細(xì)胞核中, 折疊壓縮程度高, 處于聚縮狀態(tài)，堿性染料染色時(shí)著色較深的染色質(zhì)組分。類型結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)（或組成型異染色質(zhì)）(constitutive heterochromatin) 兼性異染色質(zhì)(facultative heterochromatin) 結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，除復(fù)制期以外，在整個(gè)細(xì)胞周期均處于聚縮狀態(tài)，形成多個(gè)染色中心。 結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的特征：在中期染色體上多定位于著絲粒區(qū)、端粒、次縊痕 及染色體臂的某些節(jié)段；由相對(duì)簡(jiǎn)單、高度重復(fù)的DNA序列構(gòu)成, 如衛(wèi)星DNA；具有顯著的遺傳惰性, 不轉(zhuǎn)錄也不編碼蛋白質(zhì)；在復(fù)制行為上與常染色質(zhì)相比表現(xiàn)為晚復(fù)制早聚縮兼性異染色質(zhì)在某些細(xì)胞類型或一定的發(fā)育階段, 原來(lái)的常染色質(zhì)聚縮, 并喪失基因轉(zhuǎn)錄活性, 變?yōu)楫惾旧|(zhì)，如X染色體隨機(jī)失活。 異染色質(zhì)化可能是關(guān)閉基因活性的一種途徑。 ▲DNase的敏感性和基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，活躍表達(dá)基因所在染色體上一般含有一個(gè)或數(shù)個(gè)DNA酶Ⅰ超敏感位點(diǎn)，超敏感位點(diǎn)的產(chǎn)生可能什染色質(zhì)結(jié)構(gòu)規(guī)律性變化的結(jié)果。正是這種變化，使DNA容易與RNA聚合酶和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相結(jié)合，從而啟動(dòng)基因表達(dá)，同時(shí)更易于被核酸酶所降解。當(dāng)一個(gè)基因成為轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)時(shí)，含有這個(gè)基因的染色質(zhì)區(qū)域?qū)NaseⅠ（一種內(nèi)切酶）降解的敏感性要比無(wú)轉(zhuǎn)發(fā)活性區(qū)域高得多。這是由于此區(qū)域染色質(zhì)的DNA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，DNaseⅠ易于接觸到DNA之故。一個(gè)很好的研究系統(tǒng)是雞的珠蛋白和卵清蛋白系統(tǒng)。來(lái)自雞胚紅細(xì)胞的核中，珠蛋白的基因?qū)NaseⅠ的降解是敏感的，而編碼卵清蛋白的基因在紅細(xì)胞中是不表達(dá)的，它對(duì)DNaseⅠ的降解也是具有抗性的。相反，在母雞輸卵管細(xì)胞的核中，卵清蛋白的基因是具有轉(zhuǎn)錄活性的，但卻不能產(chǎn)生珠蛋白的RNA，卵清蛋白基因的序列對(duì)DNaseⅠ 的降解要比珠蛋白基因的序列敏感得多。很多實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論幾乎都是有轉(zhuǎn)錄活性的基因?qū)NaseⅠ的敏感性增加，DNaseⅠ敏感區(qū)的范圍隨著基因序列的不同而變化，從基因周圍幾個(gè)Kb到兩側(cè)20Kb大小不等。仔細(xì)分析具有轉(zhuǎn)錄活性基因周圍的DNA區(qū)域，表明有一個(gè)中心區(qū)域存在，稱為超敏感區(qū)域（hypersensitive region）或超敏感位點(diǎn)（hypersensitive site），它對(duì)DNaseⅠ是高敏感的。這些位點(diǎn)或區(qū)域?qū)⑹紫仁艿紻NaseⅠ的剪切。由于對(duì)DNaseⅠ的敏感性反映了染色質(zhì)中DNA的有效性，我們將這些位點(diǎn)描述為染色質(zhì)中特殊DNA暴露區(qū)域，一般在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近，即5′端啟動(dòng)子區(qū)域，少部分位于其它部位如轉(zhuǎn)錄單元的下游。超敏感位點(diǎn)建立于轉(zhuǎn)錄起始之前，轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)物除去后雖超敏感位點(diǎn)信然存在，但轉(zhuǎn)錄卻很快停止，說(shuō)明超敏感位點(diǎn)的存在是轉(zhuǎn)錄起始的必要條件，但不是充分條件。超敏感位點(diǎn)是一段長(zhǎng)200bp左右的DNA序列，這些區(qū)域是低甲基化區(qū)；并可能有局部解鏈的存在；不存在核小體結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)不同尋常，此區(qū)因DNA的裸露易和多種酶或特異的蛋白質(zhì)結(jié)合，也就是說(shuō)易于和反式作用因子結(jié)合。2) DNA的甲基化和去甲基化A日常型甲基化酶 在甲基化的DNA模板指導(dǎo)下使新合成的鏈甲基化。特異性很強(qiáng)，對(duì)半甲基化的DNA有較高的親和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，從而保證DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂后甲基化模式不變。B 從頭合成型甲基化酶 無(wú)需模板指導(dǎo)完成甲基化修飾。不需要母鏈指導(dǎo)，但速度很慢。C在一些不表達(dá)的基因中，啟動(dòng)區(qū)的甲基化程度很高，而處于活化狀態(tài)的基因則甲基化程度較低?，F(xiàn)以卵黃原蛋白Ⅱ基因?yàn)槔齺?lái)說(shuō)明這個(gè)問(wèn)題。卵黃蛋白并非在卵母細(xì)胞或受精卵中合成的，而是在成熟的雌性動(dòng)物肝中先合成卵黃蛋白原（vetellogenin），然后分泌到血液中，再運(yùn)送到卵巢。發(fā)育中的卵（卵母細(xì)胞）選擇性地將卵巢中的卵黃蛋白原加以吸取，再切割，裝配成卵黃蛋白。雄性動(dòng)物也有卵黃蛋白原基因，但不能表達(dá)。這是因?yàn)槿狈Υ萍に刂省Ｆ浞肿訖C(jī)制仍和甲基化有關(guān)。雞的卵黃蛋白原基因的5′調(diào)節(jié)區(qū)有4個(gè)CpG位點(diǎn)（圖1843），C，D位點(diǎn)是雌二酮受體蛋白復(fù)合物的結(jié)合部位。在雌激素處理后，在612（C）的HpaⅡ位點(diǎn)處于低甲基化。在紅細(xì)胞DNA的上面一股鏈上4個(gè)位點(diǎn)全部甲基化，下股鏈只有50%甲基化，但經(jīng)雌二酮處理后數(shù)小時(shí)內(nèi)甲基化的形式發(fā)生急劇變化，上股鏈中4個(gè)位點(diǎn)全部去甲基化，與卵黃蛋白原mRNA相吻合，而另一股鍵上4個(gè)位點(diǎn)滯后24小時(shí)才去甲基化，這就是在肝細(xì)胞中卵黃蛋白原基因中的5′端調(diào)節(jié)區(qū)有部分半甲基化位點(diǎn)，而雌激素的處理只引起其中一條鏈迅速地去甲基化，另一條鏈暫時(shí)仍保持本甲基化狀態(tài)，所以此基因在雄體中處于甲基化狀態(tài)，沒(méi)有活性。酶對(duì)CpG位點(diǎn)的甲基化是有選擇的，例如小鼠β珠蛋白基因5′側(cè)翼有5個(gè)CpG位點(diǎn)，其中4個(gè)較集中。用純化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在體外處理這段序列，結(jié)果各位點(diǎn)的甲基化程度各不相同，有的不發(fā)生甲基化，有的甲基化不明顯，有的稍有甲基化，有的大量甲基化，無(wú)論是誘導(dǎo)的還是未誘導(dǎo)的細(xì)胞；無(wú)論是純化酶，還是粗制酶都一樣。表明還有其它的選擇因素存在。甲基化可使基因失活，去甲基化又可使基因恢復(fù)活性。5氮胞苷（圖1845）沒(méi)有游離的5′H，因而不能接受甲基，若將它摻入DNA取代胞苷是可以改變基因的甲基化狀態(tài)，而達(dá)到去甲基化。細(xì)胞DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過(guò)程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨甲蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT－細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖（圖111）。Mohandas等將含有一條X染色體易位（X/11易位）的女人成纖維細(xì)胞和小鼠A9細(xì)胞（HPRT）融合后用HAT（培養(yǎng)基中加入了次黃嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胸苷(T)，選擇帶有HPRT+基因的細(xì)胞，而人類X染色體的長(zhǎng)臂上帶有此基因，若X染色體失活，這個(gè)基因也