【正文】 葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)與應(yīng)用 1931年， Kautsky和 Hirsch第一次用肉眼發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)現(xiàn)象（ Kautsky effect）距今已有 80多年，但把葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)作為一種技術(shù)應(yīng)用于光合作用的研究中則是近20年的事。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在測(cè)定葉片光合作用過(guò)程中光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨(dú)特的作用，與 “ 表觀性 ” 的氣體交換指標(biāo)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)更具有反映 “ 內(nèi)在性 ” 特點(diǎn)。因此，葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)被稱為測(cè)定葉片光合功能快速、無(wú)損的探針，并廣泛應(yīng)用于植物生理學(xué)、生態(tài)學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中。 基本概念： 綠色植物或含葉綠素的部分組織在黑暗中適應(yīng)片刻或用近紅外光預(yù)照射，然后在可見(jiàn)光下激發(fā)，并用熒光儀檢測(cè)，會(huì)發(fā)現(xiàn)植物綠色組織發(fā)出一種微弱的暗紅色的、強(qiáng)度隨時(shí)間不斷變化的熒光信號(hào)，這個(gè)過(guò)程稱為葉綠素 a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，簡(jiǎn)稱為 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué) 。 熒光來(lái)源： 由于葉綠素分子吸收的光能有一部分消耗于分子內(nèi)部振動(dòng)上，輻射出的能量就小，根據(jù)波長(zhǎng)與分子能量成反比的規(guī)律(E=hv2)，反射光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)一些。所以葉綠素溶液在入射光下呈綠色，而在反射光下呈紅色。 絕大部分植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒鈦?lái)自 PSII的天線色素系統(tǒng)，而PSI色素系統(tǒng)基本不產(chǎn)生熒光。 熒光來(lái)源： 葉綠素分子吸收量子后，由最穩(wěn)定的、最低能量的基態(tài)（常態(tài)）提高到一個(gè)不穩(wěn)定的、高能狀態(tài)的激發(fā)態(tài)。由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，迅速向較低能態(tài)轉(zhuǎn)變，能量有的以熱量的形式散失，有的以光形式散失。從第一單線態(tài)回到基態(tài)所發(fā)射的光就成為熒光。熒光的壽命很短，約為 108－ 109 s。 光合電子傳遞的” Z圖” 激發(fā)能 光化學(xué)反應(yīng)形成同化力 熱耗散 熒光 熒光測(cè)量基礎(chǔ)： 植物葉片所吸收的光能有 3個(gè)走向：光合驅(qū)動(dòng)、熱能、葉綠素?zé)晒狻?個(gè)過(guò)程之間存在競(jìng)爭(zhēng)，其中任何一個(gè)效率的增加都將造成另外兩個(gè)產(chǎn)量的下降。測(cè)量葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量，可以獲得光化學(xué)過(guò)程與熱耗散效率的變化信息。 CO2固定 光呼吸 Mehler 反應(yīng) N代謝 熒光是研究光能分配的探針 葉綠素?zé)晒?： 植物吸收的一小部分光重新以光的形式發(fā)射出來(lái) P + D + F = 1 F = 1 P D 光化學(xué)的 和 耗散性的 熒光 淬滅 (F) (D) (P) 活體葉綠素?zé)晒馐枪夂献饔玫挠行结? ? 活體狀態(tài)下，葉綠素?zé)晒鈳缀跞縼?lái)源于 PS II的 Chl a（包括天線Chl a），活體葉綠素?zé)晒馓峁┑目焖傩畔H僅反映了 PS II對(duì)激發(fā)能的利用和耗散情況 ? 光合作用過(guò)程的各個(gè)步驟密切偶聯(lián)，因此任何一步的變化都會(huì)影響到 PS II從而引起熒光變化，也就是說(shuō)通過(guò)葉綠素?zé)晒鈳缀蹩梢蕴綔y(cè)所有光合作用過(guò)程的變化 盡管葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量?jī)H占葉片吸收光能問(wèn)題的 1－ 2%，但測(cè)量卻非常簡(jiǎn)單。熒光光譜不同于吸收光譜，其波長(zhǎng)更長(zhǎng)，因此熒光測(cè)量可以通過(guò)把葉片經(jīng)過(guò)給定波長(zhǎng)的光線的照射，同時(shí)測(cè)量發(fā)射光中波長(zhǎng)較長(zhǎng)的部分光線的量來(lái)實(shí)現(xiàn)。 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量是相對(duì)的，因?yàn)楣饩€不可避免會(huì)有損失，因此，所有分析必須把數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，包括進(jìn)一步計(jì)算的許多參數(shù)。 將綠色植物或含葉綠素的部分組織，如葉片、芽、嫩枝條、莖或單細(xì)胞藻類(lèi)懸液放在暗中適應(yīng)片別，或用近紅外光預(yù)照射，然后在可見(jiàn)光下激發(fā)，并用熒光計(jì)檢測(cè)，結(jié)果就會(huì)發(fā)現(xiàn)植物綠色組織會(huì)發(fā)出一種微弱的暗紅色強(qiáng)度隨時(shí)間不斷變化的熒光信號(hào)，這過(guò)程稱為植物體內(nèi)葉綠素 a熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，簡(jiǎn)稱為葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)。 絕大部分是來(lái)自葉綠體光系統(tǒng) II(PSII)的天線色素蛋白復(fù)合體中的葉綠素 a分子，熒光發(fā)射波長(zhǎng)范圍約在 650－ 780nm，熒光發(fā)射峰在 685nm和 735nm，其熒光激發(fā)光譜與葉綠體的吸收光譜近似，熒光激發(fā)峰在 438nm與 480nm左右。 根據(jù)現(xiàn)在國(guó)際上的統(tǒng)一命名，可把熒光誘導(dǎo)曲線劃分為：O(原點(diǎn) )→I( 偏轉(zhuǎn) ) →D( 小坑 )或 pl(臺(tái)階 ) →P( 最高峰 ) →S( 半穩(wěn)態(tài) ) →M( 次峰 ) →T( 終點(diǎn) )這幾個(gè)相 (phase)。有時(shí)在 O和 I之間還可辨認(rèn)出一個(gè)扔點(diǎn)稱為 J相。其中O→P 相為熒光快速上升階段(1－ 2s)，從 P→T 為熒光慢速下降 (猝滅 )階段 (4－ 5s），在此階段，往往出現(xiàn)復(fù)雜的情況，有時(shí)沒(méi)有 M峰，有時(shí)出現(xiàn)幾個(gè)漸次降低的峰，因葉片的生理狀態(tài)不同而異。一般而言，遭受環(huán)境脅迫的葉片 M峰消失，而生理狀態(tài)良好的葉片往往在 P峰之后有幾個(gè)峰出現(xiàn)。這可能反映了同化力形成和使用之間從不平衡到平衡的一個(gè)快速的調(diào)節(jié)過(guò)程。 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué) OIDPSMT曲線 經(jīng)暗適應(yīng)的綠色植物樣品突然受到可見(jiàn)光照射時(shí)，體內(nèi)葉綠素分子可在納秒 (ns)級(jí)時(shí)間內(nèi)發(fā)出一定強(qiáng)度的熒光，此瞬時(shí)的熒光誘導(dǎo)相位稱為初相或“ O”相，此時(shí)的熒光稱為固定熒光(Fo)，然后熒光強(qiáng)度增加的速度減慢，因而在 Fo處形成拐點(diǎn)，接著以毫秒級(jí)速度形成一個(gè)緩臺(tái)階，稱為“ I”相和“ D”相，數(shù)秒后熒光強(qiáng)度可達(dá)最高點(diǎn)，稱為“ P”峰。若所用激發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到或超過(guò)被測(cè)樣品光反應(yīng)的光飽和點(diǎn)時(shí)， P峰即趨于或等于最大熒光 (Fm)。熒光強(qiáng)度超過(guò) Fo那一部分的熒光稱為可變熒光 (Fv)。在 P峰之后，植物熒光通常經(jīng) 1－ 2次阻尼振蕩 (稱較大峰“ M1”和“ M 2”)，才降到接近 Fo的穩(wěn)定的“ T”相終水平。熒光強(qiáng)度下降的過(guò)程現(xiàn)稱為熒光猝滅。根據(jù)植物材料和暗適應(yīng)時(shí)間的不同，上述熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)過(guò)程要延續(xù) 3—6分鐘左右。 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的測(cè)量可采用調(diào)制式與非調(diào)制式兩種不同方法 : 非調(diào)制式熒光計(jì)的結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，它僅需要一個(gè)強(qiáng)連續(xù)光源，此光源既作為激發(fā)光，又作為測(cè)量光，但是為了能夠捕捉到植物熒光信號(hào)上升前沿中的拐點(diǎn)，要求整個(gè)系統(tǒng)的時(shí)間分辨率達(dá)到毫秒 (ms)級(jí)。在光源與樣品之間，通常加有藍(lán)色的長(zhǎng)波截止濾光片和毫秒級(jí)電子快門(mén)?，F(xiàn)在國(guó)外也有用亮度較大的發(fā)光二極管作為光源的，由于發(fā)光二極管光源的上升前沿較快，這樣就可省去電子快門(mén)。光電轉(zhuǎn)換接收器可用光電倍增管或光電三極管，它們的光譜響應(yīng)要選擇與植物熒光發(fā)射波長(zhǎng)范圍相吻合。在接收器之前通常加有紅色的短波截止濾光片，以完全濾掉激發(fā)光。毫秒級(jí)記錄設(shè)備可用瞬態(tài)記錄器、記憶示波器或帶有 A/D轉(zhuǎn)換的計(jì)算機(jī)等。在控制電子快門(mén)與記錄熒光信號(hào)之間要有一個(gè)同步觸發(fā)裝置或同步程序，以保證取樣和記錄過(guò)程與電子快門(mén)動(dòng)作相同步。為了減少樣品對(duì)熒光的重復(fù)吸收，通常是把接受器與入射的激發(fā)光安排在樣品的同一側(cè)。 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的測(cè)量方法 調(diào)制式動(dòng)力學(xué)熒光計(jì)至少應(yīng)具有兩束光：調(diào)制的弱測(cè)量光和連續(xù)的強(qiáng)化光。為了使測(cè)量光本身完全不被接收器直接檢出，測(cè)量光中和接收器前使用的濾光片應(yīng)完全無(wú)交叉重疊的光譜成分。光化光對(duì)接收器信號(hào)的干擾，可用折光轉(zhuǎn)盤(pán)來(lái)解決。為了能夠精確地測(cè)定 Fo值，經(jīng)驗(yàn)證明測(cè)量光到達(dá)樣品表面時(shí)的強(qiáng)度要小于 10ergscm2 s1。由于該強(qiáng)度在室溫下不足以引起還原態(tài) QA的積累，因而熒光強(qiáng)度將始終保持在較低的、恒定的 Fo水平上。此時(shí)若在照有測(cè)量光的樣品上再疊加一束飽和光化光，植物熒光才迅速上升，并達(dá)到 P峰，這就是 Fv部分，此后熒光猝滅過(guò)程與前述非調(diào)制熒光猝滅過(guò)程相似。應(yīng)該著重指出的是，由于調(diào)制式動(dòng)力學(xué)熒光計(jì)采用了選頻或鎖相放大技術(shù)，使它只檢出與測(cè)量光具有相同頻率和固定相位差的植物熒光調(diào)制信號(hào)，而對(duì)其他背景光的干擾不放感。 所謂調(diào)制技術(shù)，就是說(shuō)用于激發(fā) 熒光 的測(cè)量光具有一定的調(diào)制（開(kāi) /關(guān)）頻率，檢測(cè)器只記錄與測(cè)量光同頻的熒光，因此調(diào)制熒光儀允許測(cè)量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強(qiáng)時(shí)。正是由于調(diào)制技術(shù)的出現(xiàn)，才使得葉綠素?zé)晒庥蓚鹘y(tǒng)的“黑匣子”（避免環(huán)境光）測(cè)量走向了野外環(huán)境光下測(cè)量，由生理學(xué)走向了生態(tài)學(xué)。 所謂飽和脈沖技術(shù)，就是打開(kāi)一個(gè)持續(xù)時(shí)間很短（一般小于 1 s）的強(qiáng)光關(guān)閉所有的電子門(mén)（光合作用被暫時(shí)抑制），從而使葉綠素?zé)晒膺_(dá)到最大。飽和脈沖（ Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個(gè)特例。光化光越強(qiáng)， PS II釋放的電子越多， PQ處累積的電子越多，也就是說(shuō)關(guān)閉態(tài)的 電子門(mén) 越多， F越高。當(dāng)光化光達(dá)到使所有的電子門(mén)都關(guān)閉（不能進(jìn)行光合作用）的強(qiáng)度時(shí)，就稱之為飽和脈沖。 打開(kāi)飽和脈沖時(shí)，本來(lái)處于開(kāi)放態(tài)的電子門(mén)將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔幔?F達(dá)到最大值。 經(jīng)過(guò)充分暗適應(yīng)后，所有電子門(mén)均處于開(kāi)放態(tài)，打開(kāi)測(cè)量光得到 Fo，此時(shí)給出一個(gè)飽和脈沖，所有的電子門(mén)就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃?Fm。根據(jù) Fm和 Fo可以計(jì)算出 PS II的最大量子產(chǎn)量 Fv/Fm=(FmFo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。 在光照下光合作用進(jìn)行時(shí)，只有部分電子門(mén)處于開(kāi)放態(tài)。如果給出一個(gè)飽和脈沖，本來(lái)處于開(kāi)放態(tài)的電子門(mén)將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔?，此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃?Fm’。根據(jù) Fm’和 F可以求出在當(dāng)前的光照狀態(tài)下 PS II的實(shí)際量子產(chǎn)量 Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’ =(Fm’ F)/Fm’，它反映了植物目前的實(shí)際光合效率。 在光照下光合作用進(jìn)行時(shí)，只有部分電子門(mén)處于關(guān)閉態(tài)，實(shí)時(shí)熒光 F比 Fm要低，也就是說(shuō)發(fā)生了熒光淬滅（ quenching）。植物吸收的光能只有 3條去路：光合作用、葉綠素?zé)晒夂蜔?。根?jù)能量守恒： 1＝光合作用＋葉綠素?zé)晒猓珶?。可以得出：葉綠素?zé)晒猓?1－光合作用－熱。也就是說(shuō)，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學(xué)淬滅（ photochemical quenching, qP）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學(xué)淬滅（ nonphotochemical quenching, qN或 NPQ）。光化學(xué)淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學(xué)淬滅反映了植物耗散過(guò)剩光能為熱的能力，也就是光保護(hù)能力。 體內(nèi)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)有兩個(gè)顯著的特點(diǎn)：一是它可將植物發(fā)出的熒光區(qū)分為性質(zhì)上完全不同的兩個(gè)部分 ——固定熒光 (Fo)部分和可變熒光 (Fv)部分。固定熒光 (Fo)代表不參與 PSII光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分；可變熒光 (Fv)代表可參與 PSII光化學(xué)反應(yīng)的光能輻射部分。因而根據(jù)可變熒光 (Fv)在總的最大熒光 (Fm=Fv十 F。 )中所占的比例（ Fv／ Fm)，即可簡(jiǎn)便地得出植物 PSII原初光能轉(zhuǎn)換效率，另一個(gè)特點(diǎn)是，熒光動(dòng)力學(xué)是測(cè)定植物從暗中轉(zhuǎn)到光下，其光合作用功能從休止鈍化狀態(tài)轉(zhuǎn)為局部活化狀態(tài)，直到全部正常運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)過(guò)程中的熒光動(dòng)態(tài)變化，因而它包含著十分豐富的光合信息，這遠(yuǎn)不是一般靜態(tài)焚光測(cè)量所能比擬的。 在體內(nèi)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)測(cè)定中，當(dāng)樣品的葉綠素濃度和熒光計(jì)的激發(fā)光強(qiáng)恒定時(shí)， PS II原初電子受體 QA的氧還狀態(tài)是決定體內(nèi)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)弱的主要因素。當(dāng)植物經(jīng)一段時(shí)間暗適應(yīng)，或用優(yōu)先為光系統(tǒng) I(PSl)所利用的長(zhǎng)波光照射后，其體內(nèi) PSII的 QA和隨后的電子受體 QB和 PQ庫(kù)等均完全失去電子而被氧化，這時(shí) PS II反應(yīng)中心可接受光電子，即處于“開(kāi)放”狀態(tài)，這時(shí)熒光強(qiáng)度最弱，即為 Fo，或處于“ O”初始相；當(dāng)植物被飽和光激發(fā)，使 PSII電子受體 QA、QB和 PQ庫(kù)等完全被還原時(shí)， PSII反應(yīng)中心不再接受光電子，即處于“關(guān)閉”狀態(tài)，這時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，即為 Fm，或處于“ P”峰相。植物經(jīng)短暫照光達(dá)到“ P”峰后，由于一些光合酶系逐漸被活化，使PSI開(kāi)始運(yùn)轉(zhuǎn)，而將 PSII還原側(cè)的還原態(tài)電子受體 QA、 QB和 PQH2等再氧化，從而引起熒光強(qiáng)度的猝滅，這稱為 qQ猝滅；植物在光的持續(xù)照射下，緊接著 qQ猝滅的增加，在光合膜的兩側(cè)逐漸建立起質(zhì)子梯度和形成膜高能態(tài)。試驗(yàn)證明，它們也可造成熒光猝滅，這種猝滅稱為能量猝滅，或 qE淬滅。 qQ和 qE滅是植物在正常生理?xiàng)l件下的兩個(gè)最主要的猝滅成分。 qQ猝滅因?yàn)槭怯?QA等再氧化所造成，因而它與光合電子傳遞、光合放氧等過(guò)程直接相關(guān)；而 qE猝滅因?yàn)槭怯少|(zhì)子梯度和膜高能態(tài)所引起，因而它只與 ATP的形成、積累以及與光合膜的狀態(tài)有關(guān)，而與光合電子傳遞和光合氣體交換無(wú)直接的聯(lián)系。 以上對(duì)熒光動(dòng)力學(xué)中兩種猝滅成分的分析稱為 Q分析，它對(duì)于正確理解和分析葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)猝滅過(guò)程的光合生理意義及其與其他光合參數(shù)，特別是與氣體交換的關(guān)系，是十分重要的，它消除了過(guò)去看起來(lái)似乎是相互矛盾的一些試驗(yàn)結(jié)果，從而為葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)在理論上的進(jìn)一步深入研究和在實(shí)際中的廣泛應(yīng)用掃清了障礙，這是近年來(lái)熒光動(dòng)力學(xué)在理論研究方面的重要新進(jìn)展。 根據(jù)上述 Q分析理論，西德 Schreiber博土設(shè)計(jì)了一種新型的脈沖調(diào)制熒光計(jì)，該儀器在過(guò)去一般調(diào)制熒光計(jì)的基礎(chǔ)上，又增加一束強(qiáng)飽和閃光 (≥2022Wcm2)，它以約 5秒一次的頻率，與一般段調(diào)制熒光計(jì)原有的強(qiáng)連續(xù)光化光一起，共同照射激發(fā)植物樣品，以瞬時(shí)完全消除 qQ猝滅，結(jié)果在原來(lái)熒光動(dòng)力學(xué)的曲線上，便形成許多疊加的鋸齒狀熒光脈沖，這樣從原有的熒光動(dòng)力學(xué)曲線和鋸齒狀熒光脈沖包絡(luò)線中，就可計(jì)算出 qQ和 qE兩個(gè)成分。