新手上路westernblot問題集合(已修改)
2025-01-27 09:10 本頁面
【正文】 新手上路 Western blot問題集合 對于一個新手，試驗中會遇到很多問題，我總結(jié)了一下常見問題，希望對您有所幫助。 Q1: PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？A1:一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，若反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，效果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF膜即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，效果較好。 Q2:做組織樣品的western blot的時候，處理樣品有什么訣竅？A2: 必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑制劑），封閉劑一般5%脫脂奶粉。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯的選擇 Q3:免疫組化和Western blot可以用同一種抗體嗎？A3: 免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋
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