【正文】 色譜法分析法 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 色譜理論基礎(chǔ) 第三節(jié) 氣相色譜法 2 第一節(jié) 概 述 色譜法 （ Chromatography） 又稱 “ 色譜分析 ” 、“ 色譜分析法 ” 、 “ 層析法 ” ， 是一種分離和分析方法 一 、 色譜法簡(jiǎn)介 1901年由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特 （ Tswett) 提出 最初的認(rèn)識(shí)：分離植物中的色素等有色物質(zhì) 現(xiàn)代：不再局限于有色物質(zhì) ， 也用于分離各種無(wú)色物質(zhì) 3 茨維特使用的色譜原型裝置 ， 用來(lái)分離植物葉片中的色素 。 固定相： 固定于管子中的填充物 （碳酸鈣 ） ； 流動(dòng)相： 將色素提取物置于管子上端 ， 靠重力往下流 ， 同時(shí)用 石油醚淋洗；石油醚攜帶試樣混合物流過(guò)固定相 。 色譜柱： 管子及填充物 葉綠素 A 葉黃素 胡蘿卜素 4 色譜分離原理： 當(dāng) 流動(dòng)相 中攜帶的 混合物 流經(jīng) 固定相 時(shí) ， 混合物中組分與固定相發(fā)生 相互作用 。 由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異 ， 與 固定相 之間產(chǎn)生的作用力的大小 、 強(qiáng)弱不同 ， 隨著流動(dòng)相的移動(dòng) ， 混合物在兩相間經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的 分配平衡， 使得各組分在固定相中停留的時(shí)間不同 ， 從而按一定次序由固定相中流出 。 與適當(dāng)?shù)闹髾z測(cè)方法結(jié)合 ， 實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測(cè) 。 兩相及兩相的相對(duì)運(yùn)動(dòng)構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ) 。 5 二 、 色譜法分類 按兩相物理狀態(tài)分類 氣相色譜 （ 氣體作流動(dòng)相 ） ， 氣－固色譜 、 氣－液色譜 液相色譜 （ 液體作流動(dòng)相 ） ， 液－固色譜 、 液－液色譜 6 按固定相的形式分類 柱色譜 ：固定相裝在色譜柱中 (填充柱色譜和毛細(xì)管色譜 ) 紙色譜 ：以多孔濾紙為載體，以吸附在濾紙上的水為固定相 薄層色譜 ：以涂漬在玻璃板或塑料板上的吸附劑粉末制成薄層作固定相 7 按分離過(guò)程中物理化學(xué)原理分類 吸附色譜： 吸附劑表面對(duì)不同組分的物理吸附性能差異 分配色譜 ：不同 組分在兩相中有不同的分配系數(shù) 離子交換色譜 ：利用離子交換原理 排阻色譜 ：利用多孔性物質(zhì)對(duì) 不同大小分子的 過(guò)濾 作用 親和色譜法 ：利用與親和性差異實(shí)現(xiàn)分離 按其它原理： 凝膠色譜 ， 類似排阻色譜 ， 滲透 原理 超臨界流體色譜： 特殊流動(dòng)相 8 三 、 色譜法的特點(diǎn) （ 1） 分離效率高 復(fù)雜混合物 ， 有機(jī)同系物 、 異構(gòu)體 。 （ 2） 靈敏度高 可以檢測(cè)出 106～ 109g的物質(zhì) 。 （ 3） 分析速度快 一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析 。 （ 4） 應(yīng)用范圍廣 幾乎所有的化學(xué)物質(zhì) 。 不足之處： 被分離組分 （ 未知物 ） 的定性較為困難 。 9 四、色譜分離過(guò)程及有關(guān)術(shù)語(yǔ) 色譜分離過(guò)程 A＋ B 色譜柱 檢測(cè)器 記錄儀 流動(dòng)相 10 色譜常用術(shù)語(yǔ) 色譜圖（色譜流出曲線） 試樣中的各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動(dòng)相依次進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)器將各組分濃度的變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，在記錄儀上記錄為檢測(cè)器響應(yīng)隨時(shí)間的變化的微分曲線，稱為色譜流出曲線。 11 （ 1）色譜峰 組分從色譜柱流出，檢測(cè)器對(duì)該組分的響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間變化所形成的峰形曲線。 特點(diǎn)：當(dāng)進(jìn)樣少 ， 組分濃度低時(shí) ， 呈高斯分布 12 （ 2）基線 在正常操作條件下，僅用流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線稱為基線。 特點(diǎn)：穩(wěn)定的基線應(yīng)為平行于橫軸的直線 。 Base line 13 （ 3）色譜峰高 色譜峰頂點(diǎn)到基線的垂直距離（高度）稱為色譜峰高。 h 14 （ 4） 色譜峰的區(qū)域?qū)挾? 色譜峰的區(qū)域?qū)挾仁墙M分在色譜柱中譜帶擴(kuò)張的函數(shù) ， 可以反映色譜柱的分離效能 。 在能夠?qū)⒔M分分開(kāi)的情況小 ， 峰的區(qū)域?qū)挾仍秸胶?。 度量色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N方法： （ i） 標(biāo)準(zhǔn)偏差 σ ：它是 (EF/2) 2σ E F 15 （ ii） 半高峰寬 W1/2：峰高一半處對(duì)應(yīng)的色譜峰寬 (GH) W1/2＝ G H h/2 16 （ iii） 色譜峰底寬 Wb：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)作切線與基線交點(diǎn)間 的 距離 (IJ)。 Wb＝ 4σ I J Wb 17 （ 5） 保留值 試樣各組分在色譜柱中保留行為的量度 。 它反映了組分與固定相之間相互作用的大小 保留時(shí)間 tR 保留體積 VR 18 （ i） 保留時(shí)間 tR：試樣從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間 。 相應(yīng)于試樣到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間 。 19 （ ii） 死時(shí)間 t0：不被固定相保留 （ 吸附或溶解 ） 的組分從進(jìn)樣到色譜圖上出現(xiàn)峰最大值所需的時(shí)間 。 t0 20 （ iii）調(diào)整保留時(shí)間 tRˊ ： 扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間 tRˊ ＝ tR－ t0 (iv)保留體積 VR：指從進(jìn)樣到出現(xiàn)某組分的色譜峰最大值時(shí)所通過(guò)流動(dòng)相的體積。 若色譜柱出口處流動(dòng)相流量為 F0（ ml/min），則 VR＝ tRF0 （ v）死體積 V0：死時(shí)間內(nèi)通過(guò)色譜柱流動(dòng)相的體積 V0＝ tMF0 V0：實(shí)際上是色譜柱內(nèi)流動(dòng)相所占的體積。 21 （ vi）調(diào)整保留體積 VRˊ ： VRˊ ＝ VR－ V0 （ vii） 相對(duì)保留值 γ ：在相同操作條件下 ， 兩組分的調(diào)整保留值之比 。 )1()1()2()2(RRRVVttR???????22 討論： a. γ ， 而與柱徑 、 柱長(zhǎng) 、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān) 。 色譜法中 ， 特別是氣相色譜法中 ， 廣泛使用的定性數(shù)據(jù)； b. γ ， 而不是保留值之比； c. 可表示色譜柱的選擇性 ， γ ， 兩組分的 tR’值相差越大 ， 越易分離；當(dāng) γ ＝ 1時(shí) ， 重疊 。 d. 保留值又是色譜分離過(guò)程熱力學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù)； 23 從色譜流出曲線 ， 可以得到許多重要信息 （ 1） 色譜峰數(shù)目 —— 可以判斷試樣中所含組分的最少個(gè)數(shù) 。 （ 2） 色譜峰保留值 （ 或位置 ） —— 可以進(jìn)行定性分析 。 （ 3） 色譜峰下的面積或峰高 —— 可以進(jìn)行定量分析 。 （ 4） 色譜峰的保留值及其區(qū)域?qū)挾?—— 是評(píng)價(jià)色譜柱 分離效能的依據(jù) 。 （ 5） 色譜峰兩峰間的距離 —— 是評(píng)價(jià)固定相和流動(dòng)相 選擇是否合適的依據(jù) 。 24 第二節(jié) 色譜理論基礎(chǔ) 25 如某 A、 B兩個(gè)組分的試樣 A B B A 要使兩組分完全分開(kāi)，必須滿足 （ 1）相鄰兩個(gè)組分分開(kāi)的距離要明顯，也就是說(shuō)兩個(gè)組分的保留值要有明顯的區(qū)別。 （ 2）色譜峰的區(qū)域?qū)挾龋阂?。區(qū)域擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于區(qū)域分離的速率， 26 B A 作為一個(gè)色譜理論，應(yīng)研究這兩個(gè)方面： （ 1）組分在柱中移動(dòng)的 速率 ； （ 2）組分在移動(dòng)過(guò)程中 區(qū)域變寬的程度及其影響因素 。 27 一 、 塔板理論 （ plate theory) （ 以氣 液色譜為例 ） 分配平衡：塔板理論又稱平衡理論 ， 也就是說(shuō)色譜過(guò)程可以看成是組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配平衡過(guò)程 。 Amobile Astationary （ 1） 分配系數(shù) K： 在一定溫度 、 壓力下 ， 組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的 濃度比 ， 稱為分配系數(shù) ， 用 K表示 ， 即： glccK ?? 組分在流動(dòng)相中的濃度組分在固定相中的濃度28 分配系數(shù) 一定溫度下，組分的分配系數(shù) K越大，即在液相中的濃度大（在液相中停留的時(shí)間長(zhǎng)），出峰越慢； ?試樣一定時(shí)， K主要取決于固定相性質(zhì)，選擇適宜的固定相可改善分離效果； ?每個(gè)組份在各種固定相上的分配系數(shù) K不同，試樣中的各組分具有不同的 K值是色譜分離的基礎(chǔ)； ?某組分的 K = 0時(shí)，即不被固定相保留，最先流出。 29 （ 2） 分配比 k： 在一定溫度和壓力下 ， 組分在固定相和流動(dòng)相中的 質(zhì)量之比 ， 稱為分配比 ， 用 k表示 ， 即： glmmk ?? 組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量組分在固定相中的質(zhì)量glnnk ?? 量組分在流動(dòng)相中物質(zhì)的量組分在固定相中物質(zhì)的30 分配比 k和分配系數(shù) K之間的關(guān)系： gllgggllglVVKkVVkVmVmccK????或者//其中： l：液相； g：氣相； m：質(zhì)量； C：濃度； V：體積 31 討論： a. 影響因素：柱溫 、 柱壓； b. K與 V無(wú)關(guān) ， 而 k與固定液的體積又關(guān) （ Vl) ； c. 分配比 k越大 ， 組分在固定液中的量越多 ， 相當(dāng)于柱的容量越大 ， 故 k又稱容量因子； d. 與保留值的關(guān)系 。 當(dāng)某一組分的色譜峰最高點(diǎn)出現(xiàn)時(shí) ， 說(shuō)明該組分恰好有一半的量洗脫在的流動(dòng)相中剛好流出柱子 （ 體積 VR） ，其余一半則留在柱內(nèi) ， 即留在柱內(nèi)的流動(dòng)相 （ 體積為 Vg）和固定相 （ 體積為 Vl） 中 ， 根據(jù)物料等衡原理： 32 lRlRggllglgRllgggRKVVKVVVVVccKVccVVcVcVcV??????????00且調(diào)整保留體積 V’R與分配系數(shù)成正比 。是色譜過(guò)程的基本方程，將反映 色譜行為的保留值 （