綜合性實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)的分離提取、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳及westen印跡(已修改)
2025-10-24 02:24 本頁面
【正文】 蛋白質(zhì)的分離提取、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及 Western印跡 蛋白質(zhì)的分離提取 ? 蛋白質(zhì)分子在水溶液中因其表面帶有一定數(shù)量的電荷及形成水化膜使其成為穩(wěn)定的膠體顆粒。在某些物理或化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒由于 失去電荷和水化膜 而沉淀。 ? 中性鹽、重金屬鹽、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白質(zhì)的試劑。 Ⅰ 、蛋白質(zhì)的鹽析 ? 大量中性鹽類如硫酸銨 (NH4)2SO硫酸鈉 (Na2SO4)和氯化鈉 (NaCl)等加入到蛋白質(zhì)溶液后，可引起蛋白質(zhì)顆粒因失去水化膜和電荷而沉淀。 ? 各種蛋白質(zhì)分子的 顆粒大小 和 電荷數(shù)量 不同，用不同濃度中性鹽可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中沉淀。當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到飽和時(shí)血清中的白蛋白便沉淀下來。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)能保持蛋白質(zhì)不變性，加水稀釋降低鹽濃度，能使沉淀的蛋白質(zhì)重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用 鹽析法 可達(dá)到分離提純蛋白質(zhì)的目的。 Ⅱ 、重金屬鹽和三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì) ? 重金屬離子如 Pb2+、 Cu2+、 Hg2+、 Ag+等可與蛋白質(zhì)分子上的 羧基 結(jié)合生成 不溶性蛋白質(zhì)金屬鹽 而沉淀。三氯乙酸屬生物堿試劑，能與蛋白質(zhì)分子上的氨基結(jié)合而沉淀。它們均可引起蛋白質(zhì)分子的變性和失去生物學(xué)活性。 Pr NH3+ COO OH Pr NH2 COO Ag+ Pr NH2 COOAg Pr NH3+ COO CCl3COOH Pr NH3+OOCCCl3 COOH Ⅲ 、 乙醇沉淀蛋白質(zhì) ? 某些可與水混合的 有機(jī)溶劑 如甲醇、乙醇和丙酮等， 能破壞蛋白質(zhì)的水化膜 ，降低其在溶液中的穩(wěn)定性。當(dāng)加入少量中性鹽如 NaCl等或溶液 pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)膠粒上的電荷被中和，加入上述有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)沉淀。反應(yīng)在 0℃ ～ 4℃ 下進(jìn)行，并應(yīng)立即分離沉淀物，否則蛋白質(zhì)會(huì)變性。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量 一 目的與要求 SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù) 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，可帶正電荷也可帶負(fù)電荷。帶電荷的蛋白質(zhì)分子在電場中向相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。血清中各種蛋白質(zhì)在 PH 荷，在電場中向正極移動(dòng)。移動(dòng)的速度主要決定于帶電荷的多少和分子的大小。電荷多、分子小，移動(dòng)就快；反之就慢。因此，利用電泳時(shí)各種蛋白質(zhì)分子移動(dòng)的速度不同，可將血清蛋白質(zhì)分成白蛋白、 αα β、 γ球蛋白等幾條區(qū)帶。 二 實(shí)驗(yàn)原理 ?離子型去污劑 SDS（十二烷基硫酸鈉）可與蛋白質(zhì)相作用，破壞蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性，失去原有的空間構(gòu)象，形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 ，使各種蛋白質(zhì)分子相互間只保持著分子大小的差異，彼此間原有的電荷差異被消除或大大降低。當(dāng) SDS被引入聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)并進(jìn)行電泳時(shí)，樣品中蛋白持原有的電荷差異已不起作用，蛋白質(zhì)分子在電場中的遷移速度僅僅取決人于各自分子的大小。 ?將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)其分子量的對(duì)數(shù)作圖時(shí)，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。此時(shí)，將未知分子量的蛋白質(zhì)樣品，在相同的條件下進(jìn)行電泳，就可根據(jù)此蛋白質(zhì)的電泳遷移率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得它的分子量。 電泳技術(shù)分類 淀粉凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳凝膠支持物區(qū)帶電泳紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳 薄層電泳非凝膠支持物電泳用支持物區(qū)帶電泳顯微電泳 等電聚焦電泳 等速電泳不用支持物電泳是否用支持物幾種常見電泳的比較 類型 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 紙電泳 設(shè)備操作簡單 分辨率差，電滲 現(xiàn)象 醋酸纖維薄膜電泳 設(shè)備操作簡單，樣品用量少 分辨率差 瓊脂糖凝膠電泳 快速，分辨率高 電滲現(xiàn)象嚴(yán)重 聚丙烯酰胺凝膠電泳 可調(diào)節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無電滲現(xiàn)象 高濃度凝膠難剝離 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： (1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好； (2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶； (3)對(duì) pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4)幾乎無吸附和電滲作用，只要 Acr純度高，操作條件一致，
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