綜合性實驗蛋白質的分離提取、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳及westen印跡(已修改)
2024-10-29 02:24 本頁面
【正文】 蛋白質的分離提取、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及 Western印跡 蛋白質的分離提取 ? 蛋白質分子在水溶液中因其表面帶有一定數量的電荷及形成水化膜使其成為穩(wěn)定的膠體顆粒。在某些物理或化學因素影響下，蛋白質顆粒由于 失去電荷和水化膜 而沉淀。 ? 中性鹽、重金屬鹽、三氯乙酸和乙醇等都是常用的沉淀蛋白質的試劑。 Ⅰ 、蛋白質的鹽析 ? 大量中性鹽類如硫酸銨 (NH4)2SO硫酸鈉 (Na2SO4)和氯化鈉 (NaCl)等加入到蛋白質溶液后，可引起蛋白質顆粒因失去水化膜和電荷而沉淀。 ? 各種蛋白質分子的 顆粒大小 和 電荷數量 不同，用不同濃度中性鹽可使各種蛋白質分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中沉淀。當硫酸銨濃度達到飽和時血清中的白蛋白便沉淀下來。鹽析沉淀蛋白質時能保持蛋白質不變性，加水稀釋降低鹽濃度，能使沉淀的蛋白質重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用 鹽析法 可達到分離提純蛋白質的目的。 Ⅱ 、重金屬鹽和三氯乙酸沉淀蛋白質 ? 重金屬離子如 Pb2+、 Cu2+、 Hg2+、 Ag+等可與蛋白質分子上的 羧基 結合生成 不溶性蛋白質金屬鹽 而沉淀。三氯乙酸屬生物堿試劑，能與蛋白質分子上的氨基結合而沉淀。它們均可引起蛋白質分子的變性和失去生物學活性。 Pr NH3+ COO OH Pr NH2 COO Ag+ Pr NH2 COOAg Pr NH3+ COO CCl3COOH Pr NH3+OOCCCl3 COOH Ⅲ 、 乙醇沉淀蛋白質 ? 某些可與水混合的 有機溶劑 如甲醇、乙醇和丙酮等， 能破壞蛋白質的水化膜 ，降低其在溶液中的穩(wěn)定性。當加入少量中性鹽如 NaCl等或溶液 pH接近等電點時，蛋白質膠粒上的電荷被中和，加入上述有機溶劑可使蛋白質沉淀。反應在 0℃ ～ 4℃ 下進行，并應立即分離沉淀物，否則蛋白質會變性。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質分子量 一 目的與要求 SDS－聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分離蛋白質技術 蛋白質是兩性電解質，可帶正電荷也可帶負電荷。帶電荷的蛋白質分子在電場中向相反的電極移動，稱為電泳。血清中各種蛋白質在 PH 荷，在電場中向正極移動。移動的速度主要決定于帶電荷的多少和分子的大小。電荷多、分子小，移動就快；反之就慢。因此，利用電泳時各種蛋白質分子移動的速度不同，可將血清蛋白質分成白蛋白、 αα β、 γ球蛋白等幾條區(qū)帶。 二 實驗原理 ?離子型去污劑 SDS（十二烷基硫酸鈉）可與蛋白質相作用，破壞蛋白質分子的非共價鍵，使蛋白質變性，失去原有的空間構象，形成帶負電荷的 SDS蛋白質復合物 ，使各種蛋白質分子相互間只保持著分子大小的差異，彼此間原有的電荷差異被消除或大大降低。當 SDS被引入聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)并進行電泳時，樣品中蛋白持原有的電荷差異已不起作用，蛋白質分子在電場中的遷移速度僅僅取決人于各自分子的大小。 ?將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對其分子量的對數作圖時，可得到一條標準曲線。此時，將未知分子量的蛋白質樣品，在相同的條件下進行電泳，就可根據此蛋白質的電泳遷移率，在標準曲線上查得它的分子量。 電泳技術分類 淀粉凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳凝膠支持物區(qū)帶電泳紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳 薄層電泳非凝膠支持物電泳用支持物區(qū)帶電泳顯微電泳 等電聚焦電泳 等速電泳不用支持物電泳是否用支持物幾種常見電泳的比較 類型 優(yōu)點 缺點 紙電泳 設備操作簡單 分辨率差，電滲 現象 醋酸纖維薄膜電泳 設備操作簡單，樣品用量少 分辨率差 瓊脂糖凝膠電泳 快速，分辨率高 電滲現象嚴重 聚丙烯酰胺凝膠電泳 可調節(jié)凝膠孔徑，樣品用量少分辨率高，無電滲現象 高濃度凝膠難剝離 聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： (1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好； (2)化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，在很多溶劑中不溶； (3)對 pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4)幾乎無吸附和電滲作用，只要 Acr純度高，操作條件一致，
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