【正文】 I 木蹄層孔菌 Lac 的酶學(xué)性質(zhì)研究 摘 要 本文對木蹄層孔菌漆酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。結(jié)果如下：以 ABTS 作為底物，酶反應(yīng)的最適溫度為 50℃ ；最適 pH 值為 3；在 40176。C 以下保持酶活力相對穩(wěn)定， 50176。C 酶活性基本全部喪失 ；在pH 值 ~4 范圍內(nèi)保持相對較高的酶活力。 10mM/L 的 Ba2+、 Ca2+、 Co+、 Fe3+、 Na+、 K+這六個金屬離子對漆酶酶活有較強的抑制作用，其中 Fe3+的抑制作用最強，而 Mg2+， Cu2+對兩種漆酶均有激活作用。 以 ABTS 為底物時，漆酶的 Km 值為 。 關(guān)鍵詞 ： 木蹄層孔菌，漆酶，酶學(xué)性質(zhì) II ENZYMATIC PROPERTIES STUDY OF TINDER FUNGUS LACCASE ABSTRACT In this paper, the tinder fungus enzymology properties of laccase were studied. Results are as follows: to ABTS as substrate, the enzyme reaction of the optimum temperature is 50 ℃ 。 The optimal pH value is 3。 Enzyme activity stabilization are under 40 176。 C, basic all lose enzyme activity under 50 176。 C。 Within the scope of the pH value of ~ 4 remained relatively high enzyme activity. 10 mm/L Co+, Ca2+, Ba2+, Fe3+, Na+, K+ the six metal ions on laccase enzyme activity had a stronger inhibitory effect, one of the strongest inhibitory effect of Fe3+, and Mg 2+, Cu2+ effect on two kinds of laccase are activated. ABTS as substrates, laccase Km value tendency for L. Key words: tinder fungus， laccase， enzymatic properties III 目 錄 第 1章 緒論 ....................................................................... 1 ..................................................... 1 ........................................................... 1 ............................................................. 2 ............................................................... 3 第 2 章 材料和方法 ................................................................. 4 ............................................................... 4 .................................................................... 4 、試劑 ........................................................... 4 ................................................................. 5 ..................................................................... 5 ......................................................... 5 ............................................................. 5 ............................................................. 6 ........................................................... 7 第 3章 結(jié)果與分析 ................................................................. 8 pH值及 pH穩(wěn)定性 ..................................................... 8 ........................................................... 9 ............................................ 10 .......................................................................... 10 第 4章 討論 ...................................................................... 12 致 謝 ............................................................................ 13 參考文獻 ......................................................................... 14 第 1 頁 共 14 頁 第 1 章 緒論 木蹄層孔菌國內(nèi)外研究進展 木蹄層孔菌 (Fomes fomentarius(L.:Fr.)Kick.)是一種多孔菌科的高等藥用真菌，是世界性分布的木腐性真菌 [1]。它們生長在 北美洲 及 歐洲 的 樺木屬 及 水青 岡屬 。單一顆樹上就可以有多個 子實體 。木蹄層孔菌并不能食用，由于其 擔(dān)子果 可以 陰燃 幾個小時，故可以用來點火。子實 體大至巨大，馬蹄形，無柄。多呈灰色，灰褐、淺褐色至黑色，有一層厚的角質(zhì)皮殼及明顯環(huán)帶和環(huán)梭，邊緣鈍。菌管多層，軟木栓質(zhì)，多年生，生于櫟、樺、楊、柳、椴、榆、 水曲柳 、梨、李、蘋果等闊葉樹干上或木樁上。 子實體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，代表物質(zhì)就是木蹄多糖 [ 4]。 往往在生境陰濕或較黑暗的生境出現(xiàn)棒狀畸形子實體。分布于我國香港、廣東、廣西、云南、貴州、河南、陜西、四川 、湖南、湖北、山西、河北、內(nèi)蒙古、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江、西藏、新疆等地區(qū) [2]。 在 18 世紀(jì)和 19世紀(jì)，木蹄層孔菌曾被用來作為止血的膏藥，在一些傳統(tǒng)的藥典中被用來作為針灸的工具 [5]。在中國和亞洲其他許多國家，木蹄子實體水煎服廣泛用于治療食管癌、胃癌、口腔潰瘍、腸胃失調(diào)、發(fā)炎和各種感冒等疾病 [67]。國內(nèi)外對木蹄的研究結(jié)果表明，木蹄具有顯著抑制腫瘤細胞生長、增強機體免疫功能和抗氧化等功效。目前，對木蹄層孔菌的研究主要是對其甲醇、乙醇、乙酸乙 酯 、氯仿、石油醚、正丁醇的提取物的抗腫瘤活性進行研究 [5]。 有學(xué)者對木蹄層孔菌子實體化學(xué)成分做研究表明其含有酚、有機酸、苷類等 [8]。研究表明其子實體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，其中的多糖具有抗腫瘤和免疫刺激活性。 漆酶國內(nèi)外研究進展 漆酶即多酚氧化酶，是一種藍色多銅氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作為氧化劑，氧化木質(zhì)素中酚型單元成為酚氧游離基，同時還原分子氧生成水。在 ABTS 存在時，能氧化木質(zhì)素中的非酚型單元，并且其催化過程不需要 H2O2參與，因此它在催化木質(zhì)素降解時有一定的優(yōu)越性 [9]。漆酶按來源可分為漆樹漆酶、真菌漆酶和細菌漆酶，其中 以真菌漆酶為主。在產(chǎn)漆酶的真菌中最重要的是擔(dān)子菌中的白腐菌。白腐真菌漆酶通常以多重基因編碼的同工酶形式出現(xiàn)，有來源廣泛、單第 2 頁 共 14 頁 電子氧化還原電位高、可以催化降解多環(huán)芳烴類物質(zhì)等特點 [10]。 由于漆酶底物的廣泛和人們對漆酶介質(zhì)的不斷研究，漆酶的商業(yè)用途也越來越廣泛。目前漆酶的研究主要集中于對漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，酶活測定，發(fā)酵條件研究這方面，已有利用漆酶降解木材中的木質(zhì)素、生產(chǎn)酒精和利用漆酶區(qū)分嗎啡和可卡因的先例 [11]。 漆酶理化性質(zhì) 漆酶的作用底物具有廣泛性，但對氧具有 專一性 。 漆酶催化苯酚類芳香胺等物質(zhì) 的 整個催化過程大致包括 ： 酶分子對底物的作用 、 電子在酶分子中的傳遞 、 氧分子對酶分子的還原 。 就酚類化合物和芳香胺類化合物而言，漆酶利用氧分子作為電子受體，從被氧化的底物分子中，通過單電子提取方式從多酚類化合物的 o位和 p位的 OH和芳胺中去除一個 H原子，形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，進一步發(fā)生聚合或解聚反應(yīng)，引起重排 、 二聚 、 烷基 芳基斷裂 、 芐醇氧化 、 側(cè)鏈和芳環(huán)的斷裂或生成醌等一系列的非酶促反應(yīng) 。 在氧的存在下，還原態(tài)漆酶被氧化，氧分子被還原為水。 漆酶 催化不同類型底物氧化反應(yīng)的機 理主要表現(xiàn)在兩方面：一方面是底物自由基中間體的生成。在這一過程中，漆酶從被氧化的底物分子中提取一個電子，使之形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，可進一步發(fā)生聚合或解聚反應(yīng)。在 O2存在下，還原態(tài)漆酶被氧化， O2被還原為水。另一方面，漆酶催化底物氧化和對 O2的還原是通過四個銅離子協(xié)同傳遞電子和價態(tài)變化來實現(xiàn)的。漆酶催化 4 個連續(xù)的單電子轉(zhuǎn)移氧化還原性底物，將分子氧還原為水。還