【正文】 本 科 畢 業(yè) 論 文 第Ⅰ頁(yè) 共Ⅰ頁(yè) 目 錄1 緒論 1　植酸與植酸酶 1 植酸酶的分類 3 植酸酶的來源 4 植酸酶的基本酶學(xué)性質(zhì) 6 植酸酶的作用機(jī)理 6 植酸酶的應(yīng)用意義 7第2章 植酸酶發(fā)酵過程主要影響因素研究 9 試驗(yàn)材料 11 試驗(yàn)方法 11 試驗(yàn)結(jié)果與討論 14 本章小結(jié) 25結(jié) 論 26參考文獻(xiàn) 27致謝 29本 科 畢 業(yè) 論 文 第27 頁(yè) 共29頁(yè) 1 緒論自從人類畜牧業(yè)產(chǎn)生以來，最大限度的發(fā)揮家畜的生產(chǎn)潛力和生產(chǎn)價(jià)值一直是生產(chǎn)者們和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)家們共同追求的目標(biāo)，因此，在配置家畜飼料時(shí)，他們從來不考慮家畜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和礦物元素的排泄量，而導(dǎo)致大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和礦物元素隨動(dòng)物的糞便排出體外。在廣大農(nóng)村，分散而且低密度的圈養(yǎng)條件下，動(dòng)物的排泄物是一種非常好的有機(jī)肥料，但隨著畜牧業(yè)大力發(fā)展，畜牧業(yè)生產(chǎn)集約化的程度大幅度的提高，飼養(yǎng)密度和飼養(yǎng)規(guī)模急劇增加，必然導(dǎo)致在較小的面積上產(chǎn)生出大料的排泄物。這些排泄物不得到合理的分散和處理，便會(huì)對(duì)周圍的環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。豬雞等家畜，由于是單胃動(dòng)物，胃中缺乏植酸酶，對(duì)植物性飼料中的磷的利用率非常低，為滿足單胃動(dòng)物對(duì)磷的需求量，生產(chǎn)中不得不在飼料中添加大量的無機(jī)磷，結(jié)果大量的未消化的無機(jī)磷隨動(dòng)物糞便排泄稻周圍環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了很嚴(yán)重的威脅。目前，國(guó)內(nèi)外大量的實(shí)驗(yàn)證明，在家畜的飼料中添加植酸酶可以提高家畜對(duì)磷的利用率，從而可以減少向環(huán)境中排放的磷。植酸酶是一種可作為飼料及食品添加劑的新型酶制劑，可以分解動(dòng)物飼料中的植酸磷，釋放出動(dòng)物能直接吸收的利用的磷，可以有效減少單胃動(dòng)物的排便中磷的含量，因此可以減少磷對(duì)環(huán)境的污染。在飼料中添加少量的植酸酶可以代替添加大量?jī)r(jià)格昂貴的無機(jī)磷酸鈣，使飼料成本降低，而飼料的綜合利用率提高。植酸酶還能消除植酸對(duì)多種金屬離子的螯合作用，可以提高動(dòng)物對(duì)植物蛋白和多種礦物元素的利用率以及植物性飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。植酸酶因其多方面的應(yīng)用特點(diǎn)，植酸酶已成為飼料、醫(yī)學(xué)、人類營(yíng)養(yǎng)、食品工業(yè)、植物生理學(xué)和植物育種等領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)?！≈菜崤c植酸酶 植酸磷是動(dòng)植物的重要元素，作為一種必須的礦物元素在動(dòng)植物營(yíng)養(yǎng)中發(fā)揮著非常重要的作用①磷是動(dòng)植物核酸、核蛋白和磷脂的重要成分，并與蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分裂、細(xì)胞的生長(zhǎng)有著密切關(guān)系。②磷是許多輔酶如NAD+、NADP+等的成分，也是ATP和ADP的成分。③磷在機(jī)體內(nèi)參與碳水化合物的代謝和運(yùn)輸，如在光合作用和呼吸作用的生理過程中，糖的合成、轉(zhuǎn)化、降解大多數(shù)是在磷酸化以后才起反應(yīng)的。④磷對(duì)氮的代謝有重要作用，如硝酸還原有NAD和FAD的參與，而磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺則參與氨基酸的轉(zhuǎn)化。⑤磷還與脂肪轉(zhuǎn)化有關(guān)，脂肪代謝需要NADPH、ATP、CoA和NAD+的參與。68%80%的磷在植物性飼料中都是以植酸的方式存在[1]。植酸( phy tic acid, 簡(jiǎn)稱PA) 又名肌醇六磷酸, 是維生素B 族的一種肌醇六磷酸酯, 化學(xué)名環(huán)己六醇 1, 2, 3, 4, 5, 6 六磷酸二氫酯。由1分子肌醇和6分子磷酸結(jié)合而成，分子式為C6H18024P6，通式為C6H6[OP(OH)2] 。植酸廣泛以植酸鈣鎂鉀鹽存在于植物種子內(nèi)，是許多植物組織中磷的主要存在方式，占總磷的60%90% 。植酸對(duì)大多數(shù)金屬離子有極強(qiáng)的絡(luò)合能力，絡(luò)合能力與EDTA類似。植酸二價(jià)以上金屬鹽均可定性沉淀[2]。在飼料中，植物性的飼料含有約1%~ 4%的磷, 其中60%~ 80% 的磷通常是以植酸磷的形式穩(wěn)定的存在于植酸鹽復(fù)合物中, 這些礦物磷只有在植酸磷被分解游離的情況下才能供家畜吸收及利用, 單胃動(dòng)物, 如豬和家禽消化道內(nèi)缺乏植酸酶, 因而對(duì)磷的吸收率非常低。另外植酸不僅能夠螯合Ca2+ 、Mg 2+ 、Zn2+ 、Fe2+ 等二價(jià)金屬離子, 降低了礦物質(zhì)在腸道中的吸收；植酸還能與蛋白質(zhì)和氨基酸等螯合，抑制體內(nèi)消化酶的酶活性。植酸的存在大大降低了蛋白質(zhì)及脂肪物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，使多種微量元素和常量元素的利用率降低,降低了植物性飼料的整體生物作用。 植酸酶植酸酶(phytase)，是催化植酸鹽及植酸水解成為磷酸和肌醇的一類生物酶的總稱，系統(tǒng)名稱是肌醇六磷酸酶[3]，是特殊的酸性磷酸酶，是一種磷酸單脂水解酶，具有特殊的空間結(jié)構(gòu)能水解植酸釋放出肌醇和無機(jī)磷。在植物性的動(dòng)物飼料中，大部分的磷酸鹽是以植酸的形式存在的。而單胃動(dòng)物缺少分解植酸的植酸酶。為了改良磷酸鹽的生物利用度可以在植物性飼料中添加少量的異種植酸酶，減少植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用；大量減少無機(jī)磷在環(huán)境中的排泄，由此可以降低農(nóng)業(yè)生態(tài)對(duì)環(huán)境造成的負(fù)擔(dān)，并且大大減緩了江，河，湖泊及海洋的富營(yíng)養(yǎng)化；同時(shí)也大大減少了動(dòng)物飼料對(duì)無機(jī)磷的添加量，然而無機(jī)磷是一種不可再生的礦物質(zhì)資源。為保護(hù)環(huán)境目前歐洲十幾個(gè)國(guó)家規(guī)定不添加植酸酶的飼料不準(zhǔn)上市[4]。 植酸酶的分類 基于最適pH 和立體專一性的植酸酶分類植酸化學(xué)名為環(huán)己六醇 1, 2, 3, 4, 5, 6 六磷酸二氫酯[5]。因植酸分子的特殊立體構(gòu)象, 植酸酶水解植酸時(shí)具有立體專一性，根據(jù)立體的專一性, 由國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPACIUBMB)目前承認(rèn)了三類常見的植酸酶（3植酸酶、5植酸酶和6植酸酶）。3植酸酶開始水解植酸時(shí)首先釋放出C3 位磷酸基團(tuán), 隨后逐漸釋放其它的磷酸基團(tuán), 5植酸酶和6植酸酶分別從C5和C6位開始水解植酸。微生物和植物絕大多數(shù)分別產(chǎn)3植酸酶以及6植酸酶。最適PH是各種酶的基本屬性之一，根據(jù)酶活性最適pH值不同，植酸酶也可大致分為兩類：酸性植酸酶和堿性植酸酶。除了芽孢桿菌和百合花粉外，大部分的生物植酸酶和植物植酸酶都屬于酸性植酸酶，為了適應(yīng)畜禽的胃腸酸性環(huán)境, 酸性植酸酶一直受到研究者的青睞和開發(fā)，因此酸性植酸酶在飼料和人類食品的適用性中比堿性植酸酶更廣泛的底物特異性而被廣泛關(guān)注。 基于結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的植酸酶分類按結(jié)構(gòu)的不同，可以將酸性植酸酶劃分為有代表性的組氨酸酸性磷酸酶(HAP)β螺旋植酸酶（BPP），紫色酸性磷酸酶（PAP），半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CPhy)。 (1)組氨酸酸性磷酸酶（HAP）大多數(shù)知名的植酸酶都是HAP，這個(gè)類的所有成員都有一個(gè)共同的活性位點(diǎn)保守序列RHGXRXP和一個(gè)水解磷酸單脂的兩步作用的機(jī)制。Wyss 和他的同事通過比較幾種來源于真菌的植酸酶的水解的特性，提出了 2個(gè)類別的HAP 植酸酶：一類底物特異活性比較寬，但是特異活性對(duì)植酸的比較低；第二類底物比較窄特異活性，但是比較高特異活性對(duì)植酸。（2）β 螺旋植酸酶（BPP）與HAP不同，BPP是最近發(fā)現(xiàn)的一類有著特殊水解機(jī)制的酶。BPP基因已經(jīng)從Bacillius subtili和 Bacillus amyloliquefaciens中獲得。該分子的三維模型近似于有6個(gè)葉片螺旋的基本結(jié)構(gòu)。搜索蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)顯示沒有其它的目前已知的磷酸酶具有這種的結(jié)構(gòu)。由于Ca2+的束縛，而具有特定熱水解活性和穩(wěn)定性。BPP有2個(gè)束縛位點(diǎn)的磷酸鹽，對(duì)它的底物的水解出現(xiàn)在鄰近的“親和位點(diǎn)”和“剪切位點(diǎn)”， “親和位點(diǎn)”加強(qiáng)了對(duì)底物親和力。Ca2+創(chuàng)造了一個(gè)有利使束縛變得容易的靜電環(huán)境。然而，目前與BPP對(duì)應(yīng)的磷酸酶已知的沒有，是否在其它的真菌或者細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)還有待于確定。 (3) 紫色酸性植酸酶（PAP）已經(jīng)從發(fā)芽的黃豆種子中分離出來了另一種植酸酶Gmphy。Gmphy 有著活性位點(diǎn)保守序列的紫色酸性磷酸酶。它的水解機(jī)制和三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)非常明確了。對(duì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果示，在植物，哺乳動(dòng)物，真菌和細(xì)菌中顯示了類似于PAP的序列。純化的Gmphy 的大小估計(jì)在70~72kda，和其它植物來源的PAP 的分子大小相近。但是Gmphy 是僅知已報(bào)道的有較高植酸酶的活性的PAP。（4）半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CPhy)目前發(fā)現(xiàn)僅存于瘤胃微生物含有半胱氨酸磷酸酶植酸酶。單胃動(dòng)物因體內(nèi)缺乏內(nèi)源性植酸酶所以不能利用植酸。調(diào)查厭氧瘤胃微生物時(shí)，Yanke 等首先發(fā)現(xiàn)一株S. ruminantium 具有植酸酶活性。經(jīng)過研究表明是一個(gè)單體蛋白的植酸酶