【正文】 原性底物結(jié)合于 T1cu 位點， T1Cu 從中提取1 個電子，該電子通過 CysHis 途徑傳遞到 T2/T3Cu三核中心位點，該位點結(jié)合了第二底物分子氧，接受 T1Cu 的電子，并傳遞給氧，使之還原為水 [12]。 漆酶的作用底物具有較大的廣譜性，初步統(tǒng)計，漆酶催化氧化不同類型的底物已達 250 個，而且還有增加的趨勢，底物結(jié)構(gòu)大致可歸納如下 [l2]：酚類及其衍生物 : 如 2， 6— 二甲氧基酚，愈創(chuàng)木酚等 。 這一類底物最容易被氧化 ； 芳胺及其衍生物： 如鄰聯(lián)茴香胺。 這類化合物結(jié)構(gòu)與酚類相似，比較容易被氧化 ； 羧酸及其衍生物：如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化 ； 一些人工合成的化合物：如 ABTS 等非酚類化合物也可以作為漆酶的底物 ； 金屬有機化合物 ： 這類底物 主要有二茂鐵類化合物 ； 其它化合物 :這類底物主要包括苯環(huán)上連有輕基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多環(huán)、稠環(huán)化合物、雜環(huán)化合物等。 第 3 頁 共 14 頁 漆酶的應(yīng)用 漆酶作為一種高效，綠色的催化劑，隨著固定化技術(shù)的不斷發(fā)展，擴大了漆酶的工業(yè)應(yīng)用范圍和前景，固定化酶在廢水處理，生物傳感器，食品行業(yè)方面中有著重要的應(yīng)用價值。 的應(yīng)用 造紙工藝中 需要去除木質(zhì)素 ， 傳統(tǒng) 高溫蒸煮去除木質(zhì)素的 紙漿得率低且污染環(huán)境 ， 而 漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解的這個特性可用于紙漿生產(chǎn)， 減少環(huán)境污染，杜絕廢水。 這是漆酶最有前景的應(yīng)用 [13]。 漆酶 還可用作 紙漿的生物漂白。漆酶來源廣泛、使用方便 ，降解木質(zhì)素效率高， 固定化后能更有效的發(fā)揮作用 。 目前 ， 漆酶介導(dǎo)系統(tǒng)己經(jīng)得到了實際應(yīng)用 [12]。 在飲料方面的應(yīng)用： 除去 啤酒和果汁等飲料 原料中的酚，提高啤酒質(zhì)量和透明度 。另外， 漆酶還在食品分子的交聯(lián)、改善生面團的性質(zhì)、增加醬油風(fēng)味、去除食品異味等工藝中發(fā)揮著重要作用。 在食用菌和藥用菌方面的應(yīng)用： 在食用菌制種過程中加入漆酶制劑能加速木質(zhì)素的分解，能為菌絲提供更豐富的養(yǎng)料，加快菌絲 吃 料，縮短培養(yǎng)時間。利用這種方法培養(yǎng)木 耳、香菇等將有益于節(jié)約成本和擴大生產(chǎn)規(guī)模 [14]。 去除氯酚類有機化合物 ： 很多研究表明，漆酶具有轉(zhuǎn)化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚等。在底物聚合過程中，有氯離子從溶液中被釋放出來，這表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。 染料降解 ： 在印染和造紙等工業(yè)過程中，大量含有染料的廢水釋放，成為當(dāng)今主要的環(huán)境問題之一。白腐菌漆酶具有廣泛的底物專一性，可以氧化芳香環(huán)化合物，對紡織染料的脫色及降解效果明顯。 漆酶在催化過程中消耗氧氣，這一過程 很容易被轉(zhuǎn)化為電信號而高靈敏地得到檢測。在免疫檢測中，漆酶有望替代辣根過氧化物酶成為新的標(biāo)記酶，因為它有如下幾個優(yōu)點：氧氣作為第二底物，不形成非產(chǎn)物型的酶 底復(fù)合物；相比于過氧化物酶，漆酶對介質(zhì)中不同價態(tài)的金屬離子濃度的敏感性較低無需特殊的儀器和試劑。同時由于漆酶能夠催化多種酚類物質(zhì)生成酚類化合物，固定化漆酶電極作為生物傳感器在酚類物質(zhì)的檢測中應(yīng)用廣泛 [15]。 第 4 頁 共 14 頁 第 2 章 材料和方法 實驗材料與儀器 菌種 木蹄層孔菌（ 東北林業(yè)大學(xué)遺傳學(xué) 實驗室提供） 實驗材料、試劑 馬鈴薯、葡 萄糖、瓊脂、麥麩、玉米、木屑、可溶性淀粉、麥芽糖、酵母汁、 蛋白胨、牛肉膏 、ABTS(1mM)、檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液（ pH3）、 75%的酒精 . 表 21 微量溶液 的配制 藥品 含量 /L MgSo4 3g MnSo4 Nacl 1g Cacl2 CuSo4 Kal(So4) 10mg 10mg 次氮基三乙酸酯（ NTA） 表 22 液 體培養(yǎng)基 配制 藥品 含量 /L 白樺木屑 10g 酒石酸銨 KH2PO4 2g 第 5 頁 共 14 頁 MgSO4 CaCl2 琥珀酸（二）甲酯 10mM() 微量元素 70ml 硫胺素（ VB1） 1mg 紫外可見分光光度計、恒溫箱、烘箱、高壓濕熱滅菌鍋、干熱鼓風(fēng)超凈臺、可調(diào)控溫度搖床、冰箱、刀、鍋、電磁爐、打孔器、鑷子、三角瓶、燒杯、容量瓶、棕色試劑瓶、移液槍、離心管、高速冷凍離心機、離心機、磁力攪拌器、酸度計。 實驗方法 木蹄層 孔菌的培養(yǎng) PDA培養(yǎng)基 在燒杯中加入 300ml 蒸餾水，將土豆去皮切成 5mm 的小方塊。去除掉蟲蛀和壞的，稱取 200g土豆料放入紗布中包好，再講紗布放入燒杯中，將燒杯置于沸水中煮 30min，拿出燒杯，將紗布擠干，再稱取葡萄糖 20g加入土豆湯中，用蒸餾水定容至 1L，加入適當(dāng)瓊脂（ 20g左右），用封口膜封口備用。 活化菌種 在微波爐中溶解土豆培養(yǎng)基，移入超凈工作臺，將培養(yǎng)基分裝在滅菌的培養(yǎng)皿中，等其形成固體后，再分別接上菌種。接菌完成后，用封口膜封好連接口，移入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度 設(shè)定為 28，在無光條件下培養(yǎng) 10 天，每天觀察菌的生長情況。 配制液體培養(yǎng)基，接菌培養(yǎng) 配制液體培養(yǎng)基（表 22），將配制好的液體培養(yǎng)基平均分配到 100ml三角瓶中，每瓶中加入 15ml培養(yǎng)基。在超凈工作臺上將活化好的菌種接到液體培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)液中用打孔器打入 3 個菌餅進行培養(yǎng)，為測酶活做準(zhǔn)備。 粗酶液的制備 第 6 頁 共 14 頁 取培養(yǎng) 10天的培養(yǎng)物 ，分別加入 3 個 ， 20176。 C， 12021r/min，離心 20min，棄沉淀，取上清液，此即為測酶活所用的粗酶液。 漆酶酶 學(xué)性質(zhì) 在大離心管中依次加入 100mM 的酒石酸鈉 （ ） 300μ L， 1mM 的 ，蒸餾水 700μ L，酶液預(yù)熱后取 500μ L 加入到離心管中混勻，轉(zhuǎn)移到比色皿中在 420nm波長下進行吸光光度值的測定，計算酶活。 最適 酶活 溫度 ：將 酶和 pH的緩沖溶液、 ABTS、蒸餾水分別在 20℃、 30℃、 40℃、 50℃、 60℃、70℃、 80℃、 90℃、 100℃的溫度下 預(yù)熱 3min后混合測酶活 ， 共 9 個處理 ， 每個處理 3 個重復(fù) ， 取平均值做曲線圖 ， 找出木蹄層孔菌漆酶的 最適 酶活 溫度。 最佳耐受溫度 ：將 酶和 pH 的緩沖溶液、 ABTS、蒸餾水分別在 20℃、 30℃、 40℃、 50℃下進行預(yù)熱 ， 共 4 個處理 ， 每個處理 3個重復(fù)，各處理 1h， 處理完畢 迅速放入冰里，混合然后在 30℃ 測酶活。 其中 40 三組設(shè)定 24h 的對照 。 pH 對漆酶的影響和漆酶的 pH 穩(wěn)定性 最適 pH： 將酶液分別和 pH 值 、 、 、 、 、 、 、 、 ABTS、蒸餾水分別在 30℃ 預(yù)熱 10min，混合測酶活 ， 共 8 個處理 ， 每個處理 3 個重復(fù)，測量三組酶活數(shù)據(jù)取平均 值做曲線圖 ， 找出木蹄層孔菌漆酶酶活最大時候的最適 pH 值。 pH 耐受：將酶液分別和 pH 為 、 、 、 、 、 、 、 、 、ABTS、蒸餾水 30℃水浴 1h 后混合測酶活 ，共 9 個處理，每個處理 3 個重復(fù)，其中 、 、 三組設(shè)定 24h的對照 ，溫度為 4，測量三組酶活數(shù)據(jù)取平均值做曲線圖，找出木蹄層孔菌漆酶 pH 耐受的范圍。 除了底物外， 反應(yīng)體系（ 100 mM 酒石酸鈉 300μl、 1mM ABTS ml、 酶液 500 μl、 H2O 685 μl/550μl、 金屬離子和抑制劑 15μl（ 1mM） /150μl（ 10mM））混合在 30176。 C預(yù)熱 10min 后混合測酶活。 15μl（ 1mM）金屬離子和抑制劑加 685μl蒸餾水， 150μl（ 10mM）金屬離子和抑制劑加 550μl蒸餾水， 以酶液事先滅活后的反應(yīng)混合液為對照 ， 測定各金屬離子對漆酶酶活力的影響。 漆酶酶促動力學(xué) Km即酶促反應(yīng)達到最大半反應(yīng)速率時的底物濃度。 在最適 pH和最適溫度下 ，測定 lac在不同第 7 頁 共 14 頁 濃度 ABTS時的酶活。做出 lac的酶促動力學(xué)曲線， 計算酶活。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 根據(jù)查證，漆酶酶活的計算公式如下 [16]： 酶的活性單位 u/L=△ A/Min（ 106247。 ε）（ TV247。 SV）和 u/L=△ A/Min（ 103247。 mε）（ TV247。 SV）。 酶的活性單位式中， △ A／ min 為每分鐘吸光度（ A）凈增或凈減的數(shù)值； ε 為摩爾消光系數(shù)； mε為毫摩爾消光系數(shù)； TV為反應(yīng)液的總體積（ ml）； SV為樣品的體積（ ml）。 3ml 反應(yīng)體系中稀釋后的酶液為 ， 100mM 的檸檬酸緩沖液 (pH3)為 300ul， 1mM 的 ABTS 溶液 ，蒸餾水 700ul。于 420nm處測定其吸光光度值，酶液最后加加完后立即 測定，測定漆酶與底物反應(yīng) 1min的吸光度 。以同體積的蒸餾水為對照組。已知 420 nm 處 ABTS摩爾消光系數(shù)ε 420= 104 L/(mol cm)[17]。 第 8 頁 共 14 頁 第 3 章 結(jié)果與分析 最適反應(yīng) pH值及 pH 穩(wěn)定性 圖 31 體系 pH值對酶活力的影響 圖 32 酶的 pH穩(wěn)定性 在相同溫度下，漆酶 相對 酶活隨 pH 的變化如圖 31 所示 ， 漆酶的最適反應(yīng) pH 值為 3。 漆酶的第 9 頁 共 14 頁 pH 耐受如 圖 32 所示 。 當(dāng) pH 低于 2 的時候，漆酶的 酶活 極低； 處理 1h 時， pH 為 和 4 時酶活都較 高 ， 處理 24h 后 酶活 仍能保持在 %~%。 處理 1h 時， 當(dāng) pH 大于 4， 酶活降級較快 。故在 pH 為 4 的時候，漆酶的酶活最穩(wěn)定 。 最適溫度及熱穩(wěn)定性 圖 33 溫度對酶活力的影響 圖 34 酶的熱穩(wěn)定性 如圖 33 所示，在反應(yīng)溫度為 50176。C 的時候，酶活最高 ， 故酶的反應(yīng)最 適 溫度為 50176。C。 在相同pH 下，漆酶溫度的耐受性見圖 34。 處理 1h 時， 30176。C 酶活力最高， 20176。C 次之，