【正文】 活下降很快，所以持續(xù)的高溫會(huì)嚴(yán)重影響漆酶的酶活性。漆酶在溫度為 50176。 根據(jù)圖 3— 7 雙倒數(shù)圖公式，計(jì)算得 Km=。 激活劑和抑制劑對(duì)酶活影響 如表 3— 1所示 ， 10mM/L DDT、 EDTA、 NaN3均對(duì)漆酶的酶活性有著抑制作用，其中 NaN3的抑制作用最強(qiáng)。C 還較穩(wěn)定，高于 50176。C 基本喪失 。 處理 1h 時(shí)， 30176。 最適溫度及熱穩(wěn)定性 圖 33 溫度對(duì)酶活力的影響 圖 34 酶的熱穩(wěn)定性 如圖 33 所示，在反應(yīng)溫度為 50176。 漆酶的第 9 頁(yè) 共 14 頁(yè) pH 耐受如 圖 32 所示 。以同體積的蒸餾水為對(duì)照組。 SV）。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析 根據(jù)查證，漆酶酶活的計(jì)算公式如下 [16]： 酶的活性單位 u/L=△ A/Min（ 106247。 15μl（ 1mM）金屬離子和抑制劑加 685μl蒸餾水， 150μl（ 10mM）金屬離子和抑制劑加 550μl蒸餾水， 以酶液事先滅活后的反應(yīng)混合液為對(duì)照 ， 測(cè)定各金屬離子對(duì)漆酶酶活力的影響。 pH 對(duì)漆酶的影響和漆酶的 pH 穩(wěn)定性 最適 pH： 將酶液分別和 pH 值 、 、 、 、 、 、 、 、 ABTS、蒸餾水分別在 30℃ 預(yù)熱 10min，混合測(cè)酶活 ， 共 8 個(gè)處理 ， 每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，測(cè)量三組酶活數(shù)據(jù)取平均 值做曲線圖 ， 找出木蹄層孔菌漆酶酶活最大時(shí)候的最適 pH 值。 漆酶酶 學(xué)性質(zhì) 在大離心管中依次加入 100mM 的酒石酸鈉 （ ） 300μ L， 1mM 的 ，蒸餾水 700μ L，酶液預(yù)熱后取 500μ L 加入到離心管中混勻，轉(zhuǎn)移到比色皿中在 420nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光光度值的測(cè)定，計(jì)算酶活。 配制液體培養(yǎng)基，接菌培養(yǎng) 配制液體培養(yǎng)基（表 22），將配制好的液體培養(yǎng)基平均分配到 100ml三角瓶中，每瓶中加入 15ml培養(yǎng)基。 實(shí)驗(yàn)方法 木蹄層 孔菌的培養(yǎng) PDA培養(yǎng)基 在燒杯中加入 300ml 蒸餾水，將土豆去皮切成 5mm 的小方塊。 漆酶在催化過(guò)程中消耗氧氣，這一過(guò)程 很容易被轉(zhuǎn)化為電信號(hào)而高靈敏地得到檢測(cè)。 去除氯酚類有機(jī)化合物 ： 很多研究表明，漆酶具有轉(zhuǎn)化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚等。 在飲料方面的應(yīng)用： 除去 啤酒和果汁等飲料 原料中的酚，提高啤酒質(zhì)量和透明度 。 這是漆酶最有前景的應(yīng)用 [13]。 這一類底物最容易被氧化 ； 芳胺及其衍生物： 如鄰聯(lián)茴香胺。另一方面，漆酶催化底物氧化和對(duì) O2的還原是通過(guò)四個(gè)銅離子協(xié)同傳遞電子和價(jià)態(tài)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 在氧的存在下，還原態(tài)漆酶被氧化，氧分子被還原為水。目前漆酶的研究主要集中于對(duì)漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究，酶活測(cè)定，發(fā)酵條件研究這方面，已有利用漆酶降解木材中的木質(zhì)素、生產(chǎn)酒精和利用漆酶區(qū)分嗎啡和可卡因的先例 [11]。漆酶按來(lái)源可分為漆樹(shù)漆酶、真菌漆酶和細(xì)菌漆酶，其中 以真菌漆酶為主。 有學(xué)者對(duì)木蹄層孔菌子實(shí)體化學(xué)成分做研究表明其含有酚、有機(jī)酸、苷類等 [8]。 在 18 世紀(jì)和 19世紀(jì)，木蹄層孔菌曾被用來(lái)作為止血的膏藥，在一些傳統(tǒng)的藥典中被用來(lái)作為針灸的工具 [5]。菌管多層，軟木栓質(zhì)，多年生，生于櫟、樺、楊、柳、椴、榆、 水曲柳 、梨、李、蘋(píng)果等闊葉樹(shù)干上或木樁上。單一顆樹(shù)上就可以有多個(gè) 子實(shí)體 。 C, basic all lose enzyme activity under 50 176。 以 ABTS 為底物時(shí)，漆酶的 Km 值為 。結(jié)果如下：以 ABTS 作為底物，酶反應(yīng)的最適溫度為 50℃ ；最適 pH 值為 3；在 40176。C 以下保持酶活力相對(duì)穩(wěn)定， 50176。 關(guān)鍵詞 ： 木蹄層孔菌，漆酶，酶學(xué)性質(zhì) II ENZYMATIC PROPERTIES STUDY OF TINDER FUNGUS LACCASE ABSTRACT In this paper, the tinder fungus enzymology properties of laccase were studied. Results are as follows: to ABTS as substrate, the enzyme reaction of the optimum temperature is 50 ℃ 。 C。木蹄層孔菌并不能食用，由于其 擔(dān)子果 可以 陰燃 幾個(gè)小時(shí)，故可以用來(lái)點(diǎn)火。 子實(shí)體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，代表物質(zhì)就是木蹄多糖 [ 4]。在中國(guó)和亞洲其他許多國(guó)家，木蹄子實(shí)體水煎服廣泛用于治療食管癌、胃癌、口腔潰瘍、腸胃失調(diào)、發(fā)炎和各種感冒等疾病 [67]。研究表明其子實(shí)體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，其中的多糖具有抗腫瘤和免疫刺激活性。在產(chǎn)漆酶的真菌中最重要的是擔(dān)子菌中的白腐菌。 漆酶理化性質(zhì) 漆酶的作用底物具有廣泛性，但對(duì)氧具有 專一性 。 漆酶 催化不同類型底物氧化反應(yīng)的機(jī) 理主要表現(xiàn)在兩方面：一方面是底物自由基中間體的生成。漆酶催化 4 個(gè)連續(xù)的單電子轉(zhuǎn)移氧化還原性底物，將分子氧還原為水。 這類化合物結(jié)構(gòu)與酚類相似，比較容易被氧化 ； 羧酸及其衍生物：如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化 ； 一些人工合成的化合物：如 ABTS 等非酚類化合物也可以作為漆酶的底物 ； 金屬有機(jī)化合物 ： 這類底物 主要有二茂鐵類化合物 ； 其它化合物 :這類底物主要包括苯環(huán)上連有輕基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多環(huán)、稠環(huán)化合物、雜環(huán)化合物等。 漆酶 還可用作 紙漿的生物漂白。另外， 漆酶還在食品分子的交聯(lián)、改善生面團(tuán)的性質(zhì)、增加醬油風(fēng)味、去除食品異味等工藝中發(fā)揮著重要作用。在底物聚合過(guò)程中，有氯離子從溶液中被釋放出來(lái)，這表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。在免疫檢測(cè)中，漆酶有望替代辣根過(guò)氧化物酶成為新的標(biāo)記酶，因?yàn)樗腥缦聨讉€(gè)優(yōu)點(diǎn)：氧氣作為第二底物，不形成非產(chǎn)物型的酶 底復(fù)合物；相比于過(guò)氧化物酶，漆酶對(duì)介質(zhì)中不同價(jià)態(tài)的金屬離子濃度的敏感性較低無(wú)需特殊的儀器和試劑。去除掉蟲(chóng)蛀和壞的，稱取 200g土豆料放入紗布中包好，再講紗布放入燒杯中，將燒杯置于沸水中煮 30min，拿出燒杯，將紗布擠干，再稱取葡萄糖 20g加入土豆湯中，用蒸餾水定容至 1L，加入適當(dāng)瓊脂（ 20g左右），用封口膜封口備用。在超凈工作臺(tái)上將活化好的菌種接到液體培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)液中用打孔器打入 3 個(gè)菌餅進(jìn)行培養(yǎng)，為測(cè)酶活做準(zhǔn)備。 最適 酶活 溫度 ：將 酶和 pH的緩沖溶液、 ABTS、蒸餾水分別在 20℃、 30℃、 40℃、 50℃、 60℃、70℃、 80℃、 90℃、 100℃的溫度下 預(yù)熱 3min后混合測(cè)酶活 ， 共 9 個(gè)處理 ， 每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù) ， 取平均值做曲線圖 ， 找出木蹄層孔菌漆酶的 最適 酶活 溫度。 pH 耐受：將酶液分別和 pH 為 、 、 、 、 、 、 、 、 、ABTS、蒸餾水 30℃水浴 1h 后混合測(cè)酶活 ，共 9 個(gè)處理，每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，其中 、 、 三組設(shè)定 24h的對(duì)照 ，溫度為 4，測(cè)量三組酶活數(shù)據(jù)取平均值做曲線圖，找出木蹄層孔菌漆酶 pH 耐受的范圍。 漆酶酶促動(dòng)力學(xué) Km即酶促反應(yīng)達(dá)到最大半反應(yīng)速率時(shí)的底物濃度。 ε）（ TV247。 酶的活性單位式中， △ A／ min 為每分鐘吸光度（ A）凈增或凈減的數(shù)值； ε 為摩爾消光系數(shù)； mε為毫摩爾消光系數(shù)； TV為反應(yīng)液的總體積（ ml）； SV為樣品的體積（ ml）。已知 420 nm 處 ABTS摩爾消光系數(shù)ε 420= 104 L/(mol 當(dāng) pH 低于 2 的時(shí)候，漆酶的 酶活 極低； 處理 1h 時(shí)， pH 為 和 4 時(shí)酶活都較 高 ， 處理 24h 后 酶活 仍能保持在 %~%。C 的時(shí)候，酶活最高 ， 故酶的反應(yīng)最 適 溫度為 50176。C 酶活力最高， 20176。處理 24h 時(shí)， 20176。C 就基本失活。 1mM/LEDTA對(duì)酶活有激活作用。 第 12 頁(yè) 共 14 頁(yè) 第 4 章 討論 白腐真菌木蹄層孔菌漆酶酶活的溫度和 pH 耐受實(shí)驗(yàn)表明，木蹄層孔菌產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)溫度為 20176。 C的時(shí)候酶活最高，但時(shí)間久了酶活會(huì)逐漸喪失。 對(duì)漆酶 pH的耐受和最適反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)反應(yīng)體系的 pH 為 3的 時(shí)候，漆酶的酶活最高。 1mM/L 時(shí)， fe3+的抑制作用最弱。 尚潔老師平易近人，指導(dǎo)認(rèn)真負(fù)責(zé)，經(jīng)常在實(shí)驗(yàn)室親自指導(dǎo)我的實(shí)驗(yàn)，解答各種疑問(wèn) 。t agree with the 第 15 頁(yè) 共 14 頁(yè) disciplinary action your employer has taken against you your employer dismisses you and you think that you have been dismissed unfairly. For more informu, take advice from one of the anisations listed under Further help. Employment tribunals are less formal than some other courts, but it is still a legal process and you will need to give evidence under an oath or affirmation. Most people find making a claim to an employment tribunal challenging. If you are thinking about making a claim to an employment tribunal, you should get help straight away from one of the anisations listed under Further help. ation about dismissal and unfair dismissal, see Dismissal. You can make a claim to an employment tribunal, even if you haven39。s antiracism taskforce, is in London for