【正文】 項(xiàng)目名稱： 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 首席科學(xué)家： 桂建芳 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所 起止年限： 2020 年 1 月 2020 年 8 月 依托部門： 中國(guó)科學(xué)院 湖北省科技廳 一、研究?jī)?nèi)容 基于擬解決的魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這 兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題， 本項(xiàng)目擬集中在魚類主要經(jīng)濟(jì)性狀如生殖、生長(zhǎng)、抗性 的功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)方面， 重點(diǎn)解析這些主要經(jīng)濟(jì)性狀的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開拓關(guān)鍵技術(shù)，其主要研究?jī)?nèi)容包括： 1） 魚類生殖基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 及其分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用基因轉(zhuǎn)移、 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降等技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤和免疫熒光定位等方法，重點(diǎn)解析魚類生殖質(zhì) (germ plasm)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示重要生殖調(diào)控基因在魚類卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換中的功能作用及其調(diào)控機(jī)制；探討魚類配子發(fā)生過程中雙親特異性甲基化在生殖調(diào)控中的作用及其及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；通過大規(guī)模 RFLP 分析等呈現(xiàn)技術(shù)，篩選雌雄個(gè)體間性別特異的 DNA 片段標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic Walking 克隆分離與性別決定和性別分化相關(guān)基因；揭示魚類性別決定和性別 分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理；篩選鑒定出可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的性別特異表達(dá)基因和分子標(biāo)記；開拓生殖調(diào)控基因和分子標(biāo)記用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 2） 魚類生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 采用 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降、整體原位雜交、細(xì)胞示蹤、免疫熒光定位以及組織碎片灌流和細(xì)胞孵育等在體和離體研究等技術(shù)，重點(diǎn)解析魚類下丘腦/垂體控制生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；揭示魚類性成熟和生長(zhǎng)的相互協(xié)調(diào)及其調(diào)控機(jī)理；探討腦腸肽 /生長(zhǎng)激素 /類胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及其對(duì)魚類生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制；揭示卵泡抑素等 抑肌素相關(guān)基因在調(diào)控魚類肌肉細(xì)胞增殖和魚肉蛋白 /脂肪平衡的作用機(jī)理；研制可控不育性轉(zhuǎn)卵泡抑素等基因的轉(zhuǎn)基因魚品系；闡明魚類個(gè)體大小調(diào)控基因的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化規(guī)律；開拓生長(zhǎng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子標(biāo)記尤其是主控基因用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 3） 魚類抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究 利用我們自主建立的分離魚類抗病毒基因的細(xì)胞模型，重點(diǎn)解析魚類干擾素系統(tǒng)和抗菌肽基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和抗病作用機(jī)理；揭示重要魚類病原與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用及其作用機(jī)制；探討在魚類抗病免疫反應(yīng)中主效基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、功能和抗病機(jī)理； 研制具有抗病性狀的雌核發(fā)育系和近交家系；鑒別出與魚類抗病性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記和等位基因及其抗病 QTL 定位；建立魚類抗病分子設(shè)計(jì)育種的理論和技術(shù)方法，開拓其可行性途徑。 采用大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因功能分析等研究手段，解析魚類抗寒基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，揭示低溫脅迫下不耐寒魚類基因表達(dá)譜與耐寒魚類基因表達(dá)譜的差異及其關(guān)鍵基因的功能；創(chuàng)制魚類抗寒機(jī)理研究模型，開拓魚類抗寒基因用于分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。 4）魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)研究 通過建立魚類數(shù)量性狀基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息 整合技術(shù)和魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的圖譜定位，揭示魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因同線性和性狀關(guān)聯(lián)性關(guān)系，闡明魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因轉(zhuǎn)錄組以及它們?cè)谌后w和家系中的功能，確定魚類經(jīng)濟(jì)性狀主效基因標(biāo)記和基因不同組合的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種效率，由此創(chuàng)建可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的數(shù)量性狀多基因聚合育種的技術(shù)路線。 通過創(chuàng)制基于蛋白分子設(shè)計(jì)、 BAC 克隆、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、 Cre/lox 基因靶位操作的穩(wěn)定、高效的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)，優(yōu)化和完善基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的魚類基因快速敲除系統(tǒng)，創(chuàng)建基于破壞原生殖細(xì)胞發(fā)生或維持的具有遺傳安全的魚類轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系 等建立可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的基因操作技術(shù)路線，并揭示性腺特異小 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用，闡明 piRNA 與互作蛋白的調(diào)控途徑，研制出持續(xù)激活的生長(zhǎng)激素受體基因的轉(zhuǎn)基因魚，揭示持續(xù)轉(zhuǎn)激活生長(zhǎng)激素受體基因與轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因魚的效應(yīng)及其信號(hào)通路的調(diào)控差異。 二、預(yù)期目標(biāo) 本項(xiàng)目的總體目標(biāo)： 針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求，通過開展重要養(yǎng)殖魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性等主要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因組研究，解析魚類生殖的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚類生長(zhǎng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、魚類抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的主控或關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù)及其技術(shù)體系，在理論上闡明魚類生殖、生長(zhǎng)、抗病和抗寒等主要經(jīng)濟(jì)性狀和重要生命現(xiàn)象的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，提出魚類良種分子設(shè)計(jì)的策略；在技術(shù)方法上，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的多基因聚合和基因操作技術(shù)，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)育種材料，創(chuàng)建魚類分子設(shè)計(jì)育種的可行性途徑。通過這些研究，使我國(guó)在魚類功能基因組研究中居國(guó)際領(lǐng)先水平，為培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖新品種奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)，為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 解析魚類生殖、 生長(zhǎng)、抗病和抗寒的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 2. 篩選鑒定 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、 可用于魚類分子設(shè)計(jì)育種的功能基因和分子標(biāo)記 30－ 50 個(gè) ； 3. 揭示魚類性別決定與分化、卵母細(xì)胞成熟和卵 胚轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制； 4. 闡明魚類生長(zhǎng)激素分泌的信號(hào)通路； 5. 闡明魚類 干擾素系統(tǒng)關(guān)鍵基因和重要抗菌基因的抗病功能及其作用機(jī)理；闡明魚類抗寒關(guān)鍵信號(hào)通路及其作用機(jī)理； 6. 建立魚類數(shù)量性狀多基因聚合育種技術(shù)； 7. 創(chuàng)建基于蛋白分子設(shè)計(jì)和遺傳安全的穩(wěn)定高效的基因操作技術(shù)； 8. 建立主要經(jīng)濟(jì)性狀功能基因組研究和分子設(shè)計(jì)育種中間的有機(jī)聯(lián)系，創(chuàng)制 2－ 3 個(gè)在生殖、生長(zhǎng) 或抗性等目 標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀上表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的育種材料； 9. 凝聚和 培養(yǎng)一批有國(guó)際影響的中青年學(xué)術(shù)帶頭人 和學(xué)術(shù)骨干 ；發(fā)表一批高質(zhì)量的學(xué)術(shù)論文，其中在有重要國(guó)際影響的期刊（ 相關(guān)領(lǐng)域引用排名前 15%的期刊或影響因子大于 5 的期刊）發(fā)表論文50 篇以上。 三、研究方案 （一）、學(xué)術(shù)思路： 針對(duì) 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和可持續(xù)發(fā)展需求， 以鯽和鯉等為主要研究對(duì)象，啟動(dòng)我國(guó) 重要養(yǎng)殖魚類功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)研究， 通過研究魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機(jī)理，篩選鑒定進(jìn)行分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，建立魚類分子設(shè)計(jì)育種的關(guān)鍵技術(shù) 及其技術(shù)體系，解決魚類分子設(shè)計(jì)育種的策略和理論基礎(chǔ)以及魚類分子設(shè)計(jì)育種的 可行性途徑這兩個(gè) 關(guān)鍵科學(xué)問題，為魚類分子設(shè)計(jì)育種的實(shí)踐和應(yīng)用以及為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展和漁業(yè)生物技術(shù)的創(chuàng)新做出貢獻(xiàn)。 （二）、技術(shù)途徑： 1. 采用 solexa 深度測(cè)序等大規(guī)模測(cè)序和基因芯片分析等手段，通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，了解魚類生殖和生長(zhǎng)不同階段、以及抗病和不抗病、耐寒和不耐寒的基因表達(dá)譜差異，經(jīng)生物信息學(xué)比較和分子特征分析，由此篩選調(diào)控魚類生殖、生長(zhǎng)、抗性的主要基因和關(guān)鍵基因； 2. 建立重要魚類基因組 BAC 庫(kù)，研究 基因的結(jié)構(gòu)，克隆分離相應(yīng)基因的啟動(dòng)子；將其啟動(dòng)子與 GFP 報(bào)告基因重組融合，利用基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)，采用流式細(xì)胞儀等篩選分析技術(shù)，進(jìn)一步研究生物學(xué)功能； 3. 建立魚類 BAC 轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用雜交方法或 PCR 方法篩選重要功能基因的BAC 克隆，在基因編碼框的適當(dāng)位置插入綠色熒光蛋白（ EGFP）基因；利用以上構(gòu)件制備轉(zhuǎn)基因魚，通過 EGFP 分析這些基因的時(shí)空表達(dá)情況及其生理學(xué)效應(yīng)； 4. 通過基因連鎖分析和原位雜交等技術(shù)，研究目的基因在染色體上的定位，揭示基因相互作用的基因組組織基礎(chǔ)； 5. 用 RTPCR、原位雜交和 Western blot 方法在 mRNA 及蛋白水平上檢測(cè)基因表達(dá)的組織特異性和時(shí)序性 。用免疫熒光定位確定其基因的蛋白產(chǎn)物的組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞定位； 6. 采用染色質(zhì) 免疫 沉淀法（ Chromatin immunoprecitation， ChIP）、凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)（ Electrophoretic Mobility Shift Assay， EMSA）等技術(shù)研究 DNA與蛋白的相互作用； 7. 采用免疫共沉淀（ Coimmunoprecipitation， CoIP）、 GSTpull down、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence resonance energy transfer， FRET）、雙分子熒光互補(bǔ)（ bimolecular fluorescence plementation， BiFC）等技術(shù)研究蛋白相互作用； 對(duì)一些重要蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析、并對(duì)其進(jìn)行泛素化、乙酰化和磷酸化等修飾分析； 8. 鑒定兩性生殖鯽魚卵子中雙親特異性甲基化、發(fā)育不等性基因， 分析單性生殖鯽魚三倍體卵子中相關(guān)同源基因啟動(dòng)子 CpG 島甲基化差異和基因表達(dá)調(diào)節(jié)差異，確定發(fā)生差異甲基化的目標(biāo)基因；比較分析兩性生殖與單性生殖鯽魚卵子基因組中差異甲基化功能基因啟動(dòng)子，鑒定差異甲基化順式調(diào)控序列。 9. 采用正常的和人工突變后的基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，輔以其它分子生物學(xué)方法如目的基因表達(dá)產(chǎn)物體內(nèi)、外誘導(dǎo)處理等來分析目的基因的生理功能； 10. 用顯微注射方法研究基因功能。將含有這些基因的真核表達(dá)載體，或在大腸桿菌中表達(dá)出的蛋白，注射到胚胎中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 11. 將目的基因的反義 RNA或其蛋白的抗體注射到胚胎中，觀察生物學(xué)效應(yīng)； 12. 對(duì)生殖調(diào)控基因而言，設(shè)立人工性反轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，分別提取不同性反轉(zhuǎn)階段實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組性腺的 mRNA 和蛋白，采用上述方法研究基因表達(dá)的時(shí)序性； 13. 對(duì)生長(zhǎng)和生殖功能基因而言，合成重要調(diào)控生長(zhǎng)生殖基因的結(jié)構(gòu)類似物或表達(dá)具有生物活性重組蛋白，取魚類的下丘腦、垂體、肝臟和性腺，通過碎片灌流和細(xì)胞孵育等離體研究方法，或直接注射結(jié)構(gòu)類似物或重組蛋白，采用放射免疫測(cè)定等方法研究其活性，測(cè)定各種靶組織、血清中調(diào)控生殖生長(zhǎng)激素的含量，分析這些生長(zhǎng)調(diào)控因子和生殖調(diào)控因子的相互作 用及其信號(hào)傳遞機(jī)制，分析它們對(duì)魚類生殖和生長(zhǎng)的影響； 14. 通過體外合成小分子 RNA，建立魚類系統(tǒng)中適用于實(shí)驗(yàn)室日常工作的、簡(jiǎn)潔、高效的 siRNA 技術(shù)平臺(tái)；通過克隆獲得的魚類來源的啟動(dòng)子構(gòu)建針對(duì)草魚出血病病毒的 siRNA 載體，建立抗病轉(zhuǎn) siRNA 基因魚模型；通過 Creloxp 介導(dǎo)的系統(tǒng)進(jìn)行魚類胚胎中的條件基因打靶研究；建立魚類胚胎干細(xì)胞和生殖干細(xì)胞系，建立魚類培養(yǎng)細(xì)胞體外基因操作和個(gè)體重建技術(shù)途徑； 15. 通過 morpholino 介導(dǎo)的基因敲降技術(shù)，配合整體原位雜交、細(xì)胞示蹤等方法，研究目的基因的生理 學(xué)功能及其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)通路和作用機(jī)理等； 16. 采用已經(jīng)建立的細(xì)胞模型，研究病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，在此基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染目的基因和 siRNA 干擾等技術(shù)手段，研究目的基因的生理學(xué)功能以及基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 17. 通過 AFLP 和微衛(wèi)星等遺傳標(biāo)記的大規(guī)模篩選，鑒定出與魚類性別等等主要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)而通過 Genomic walking 克隆鑒定相關(guān)功能基因；通過人工選育和家系分析，利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因型分析的優(yōu)勢(shì)，研究特定標(biāo)記與某些經(jīng)濟(jì)性狀（例如生長(zhǎng)、性別、抗病或抗寒）的連鎖關(guān)系，進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助育種；開展魚類生長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率等經(jīng)濟(jì)性狀的 QTL 定位分析和eQTL 定位分析； 18. 改造基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除載體系統(tǒng)，優(yōu)化基因敲除載體，引入更多的克隆位點(diǎn)，以簡(jiǎn)化特異基因敲除載體的構(gòu)建；利用 Zinc Finger Tools 網(wǎng)上軟件包（ ） ,選取代表性基因進(jìn)行鋅指結(jié)構(gòu)域的索尋，選擇連續(xù) 20 或 30 個(gè)氨基酸的合適結(jié)構(gòu)域，依據(jù)針對(duì) DNA 三聯(lián)體的經(jīng)驗(yàn)鋅指氨基酸序列，設(shè)計(jì)靶標(biāo)多肽和堿基序列；將靶標(biāo)多肽的 DNA 片段克隆到經(jīng)改進(jìn)后的基因敲除載體上；體外合成 mRNA,顯微注射；觀察表型，并利用 PCR 檢測(cè)顯微注射個(gè)體的基因型，獲得雜合體；將雜合體個(gè)體擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行相互交配，以獲得基因的兩個(gè)拷貝均缺失的純合體；系統(tǒng)分析基因缺失純合體的表型。 技術(shù)途徑的示意圖如下： 細(xì)胞示蹤等研究細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)方法、胚胎細(xì)胞移植等 體外孵育或灌流結(jié)合放射性免疫測(cè)定研究生理功能 DNA 甲基化分析 啟動(dòng)子分析 morpholino 介導(dǎo)、 siRNA 干擾等基因敲降方法 基于蛋白質(zhì)鋅指結(jié)構(gòu)的基因敲除 模式魚類（斑馬魚、青 鳉 、河豚、三棘刺魚 等 ）全基因組信息 前期 已獲得 的 大量與魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性相關(guān)基因資源 已建立 的大批魚類細(xì)胞系 魚類生殖、生長(zhǎng)和抗性的主控基因和分子標(biāo)記的功能揭示和作用機(jī)理闡明 比較轉(zhuǎn)錄基因組分析 Western、免疫組化、 WISH 等研究時(shí)空表達(dá)譜等方法 CoIP、 GSTpull down、 FRAP、 FRET、BiFC 等研究蛋白相互作