【正文】 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 EphA2在大腸腺癌中的表達(dá) 陳壬寅 李珊珊 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 第一部分 大腸腺癌中 EphA2表達(dá)及其與臨床病理學(xué)因素、 DNA倍體、細(xì)胞周期關(guān)系的研究 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 EphA2基因的介紹 ? EphA2是 Lindberg于 1990年用簡(jiǎn)并引物從人角化細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到的一個(gè) Eph（ Erythropoitinproduceing hepatocellular,Eph) 亞家族成員 。 ? 人 EphA2基因定位于 ,有 17個(gè)外顯子。 ? Eph受體家族是 已知 最大的 酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家 庭。 ? Eph家族受體激酶和他們 EFN配體 介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo) 參與神經(jīng)系統(tǒng)的基本發(fā)生過程、 神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳 遞，在細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖，組織和器官的形成、血管生成、細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附及 腫瘤的發(fā)生和腫瘤的新生血管的形成 等過程中發(fā)揮重要的和必不可少的作用。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 EphA2與腫瘤的關(guān)系 ? EphA2廣泛高表達(dá)于 不同的腫瘤組織和細(xì)胞系 ， 如： 乳腺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌，腎細(xì)胞癌等，目前認(rèn)為 EphA2參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是功能強(qiáng)大的癌基因。 ? EphA2的高表達(dá)能誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化乳腺和前列腺上皮細(xì)胞在體內(nèi)、外的惡性轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移 。 ? 應(yīng)用 EphA2蛋白的抗體靶向抑制試驗(yàn)，下調(diào) EphA2蛋白表達(dá)的同時(shí)，也抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低腫瘤的惡性程度 。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 154例大腸腺癌組織和相應(yīng)正常大腸粘膜組織均來自鄭州大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院 2020年 1月 ~2020年 12月 手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊 (其中 66例為手術(shù)切除新鮮標(biāo)本和蠟塊和 88例存檔蠟塊 ) 1份置 4%多聚甲醛中固定存放 另 2份置 82℃ 中存放 石蠟包埋、切片、 HE 染色 石蠟包埋、切片，進(jìn)行免疫組化 提取總 mRNA、 進(jìn)行RT PCR 實(shí) 驗(yàn) 標(biāo) 本 FCM檢 側(cè) DNA 倍體、細(xì) 胞周期 細(xì)胞增 殖率 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 臨床病理資料 154例（ 88例存檔石蠟包埋標(biāo)本和 66例手術(shù)切除新鮮大腸腺癌標(biāo)本）大腸腺癌患者，術(shù)前均未接受化療、放療及其他治療。其中男性 78例，女性 76例，年齡在 2385歲之間，平均年齡為 。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 66例新鮮手術(shù)切除標(biāo)本均為大腸腺癌： 分化程度 :高分化腺癌 30例，中分化腺癌 23 例，低分化腺癌 13例。 浸潤(rùn)深度 :粘膜層 10例，粘膜下層 0例，肌層 14例，漿膜層 37例，外周組織 5例。 轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 50例；有血道轉(zhuǎn)移者 1例，無血道轉(zhuǎn)移者 65例；無種植性轉(zhuǎn)移。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 88例存檔蠟塊全部為腺癌 : 分化程度：高分化腺癌 21例，中分化腺癌 18例，低分化 29例和未分化 20例； 浸潤(rùn)深度：粘膜層 62例，粘膜下層 1例，肌層 17例、漿膜層 5例，外周組織 3例； 轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 74例；有血道轉(zhuǎn)移者 11例，無血道轉(zhuǎn)移者 77例；有種植性轉(zhuǎn)移者 10例，無種植性轉(zhuǎn)移者 78例 。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 技 術(shù) 路 線 免疫組化（ SP法 ) FCM RTPCR技術(shù) 檢測(cè) 154例大腸腺癌組織和相應(yīng)正常食管組織中EphA2蛋白表達(dá) 檢測(cè) 66例大腸腺癌手術(shù)切除新 鮮 組織和相應(yīng)正常大腸粘膜手術(shù)切除新 鮮 組織中 DNA倍體、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖率 探討 EphA2表達(dá)與大腸腺癌病理臨床因素、 DNA倍體、細(xì)胞周期的關(guān)系 檢測(cè) 66例大腸腺癌手術(shù)切除新 鮮 組織和相應(yīng)正常大腸粘膜手術(shù)切除新 鮮 組織中EphA2mRNA表達(dá) 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 一 . 免疫組化 ? 步驟 （略） ? 對(duì)照組設(shè)計(jì)： 以已知 EphA2陽性食管鱗癌和正常食管粘膜腺體組織切片作為陽性對(duì)照 ， 用正常兔 IgG代替一抗作為陰性對(duì)照， 用 PBS代替一抗作為空白對(duì)照 。 ? 免疫組化結(jié)果判定及定量分析： EPhA2免疫組化陽性表達(dá)位于細(xì)胞胞漿，呈棕黃色。定量分析采用高清晰圖像處理系統(tǒng)，隨機(jī)取 10個(gè)高倍視野進(jìn)行圖像分析，對(duì)免疫組化切片檢測(cè) EphA2陽性細(xì)胞數(shù)，依據(jù)陽性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞面積的百分比和染色強(qiáng)度判斷結(jié)果。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 二 .組織中總 RNA的提取及 RTPCR ?步驟 （略） ? RNA濃度的測(cè)定 （略） ?對(duì)照設(shè)置 ：（ 1）陰性對(duì)照：以去離子水代替提取 的總 RNA，結(jié)果陰性。 ?（ 2）內(nèi)參對(duì)照：用 βactin作為內(nèi)參引物，與EphA2和 KAI1引物分別同管擴(kuò)增，結(jié)果在紫外燈下出現(xiàn)一條 330bp的熒光帶 ?結(jié)果判定 ?陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：目的 EphA2基因 RTPCR產(chǎn)物凝膠電泳后在紫外燈下分別出現(xiàn)一條 586bp的熒光帶。 實(shí) 驗(yàn) 方 法 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 取大腸腺癌和正常大腸粘膜組織 剪碎 100、 300目尼龍網(wǎng)上搓 收集細(xì)胞液， 800prm/min離心 2min 70%乙醇 (4℃ )中固定 1h LPR染液 ,避光冷藏 (4℃ )5min Stain 1ml避光 30min. 上機(jī)檢測(cè) FCM實(shí)驗(yàn)步驟： 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 FCM對(duì)照組設(shè)計(jì)和診斷標(biāo)準(zhǔn)： ? 設(shè)正常對(duì)照組：用正常人外周血淋巴細(xì)胞，即二倍體細(xì)胞作為 DNA含量 ? 和腫瘤細(xì)胞 DNA倍體、細(xì)胞周期的參考標(biāo)準(zhǔn) ? DNA倍體分析 :用 Partec流式細(xì)胞儀 ,計(jì)數(shù) 10000個(gè)細(xì)胞 ,具有相同 DNA含 ? 量的細(xì)胞群表現(xiàn)為直方圖中獨(dú)立的峰 ,即每個(gè)峰表示一定 DNA含量或倍體 ? 的細(xì)胞亞群。在正常對(duì)照組中 ,第 1個(gè)峰代表單倍體 (2C)細(xì)胞亞群 ,在實(shí)驗(yàn) ? 組中，第 1個(gè)峰代表雙倍體 (G0/G1 ,2C)細(xì)胞亞群 ,第 3個(gè)峰則代表四倍體 ? (G2/M， 4C)細(xì)胞亞群，兩峰之間代表 S期細(xì)胞亞群。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)算出每 ? 個(gè)峰下的面積所表示的該倍體的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。 ? 診斷標(biāo)準(zhǔn) :根據(jù)左連富的標(biāo)準(zhǔn) ,DNA倍體單倍體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與正常對(duì)照組 ? 單倍體細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)相比較 ,在其兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)為正常 ,否則為異常。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 FCM計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)： ? DNA指數(shù) (DI)計(jì)算公式： DI=樣品細(xì)胞 G1峰道數(shù)均值 247。 正常組織細(xì)胞 G1峰道數(shù)均值。 ? DNA含量分析 :以 DNA指數(shù) (DI)表示細(xì)胞 DNA相對(duì)含量，根據(jù) DI值判斷 DNA倍體。 ≤DI ≤1. 1 為 DNA二倍體 。DI 0. 9 或 1. 1 為異倍體。 ? 細(xì)胞周期分布的計(jì)算：運(yùn)用 DNA細(xì)胞分析軟件，計(jì)算出各時(shí)相的分布百分比，以 S期細(xì)胞比率 (SPF)和增殖指數(shù)（ PI）表示細(xì)胞的增殖活性。 ? SPF( %) = [ S 247。 ( G0/ G1 + S + G2M) ] 100 % ? PI=[(S+G2)247。 （ G1+S+G2） ] 100% 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均經(jīng) SPSS 。計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率，計(jì)量資料用采用 X177。 S表示；陽性率之間的比較采用 χ2檢驗(yàn)（ chisquare）及 Fisher確定概率計(jì)算法；兩組均數(shù)的比較用 t檢驗(yàn) (ttest)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析（ ANVOA）和 Spearman等級(jí)相關(guān)分析； 兩變量之間的關(guān)系分析采用相關(guān)分析；多變量之間的關(guān)系分析采用 秩和 Chisguare 檢驗(yàn)；行程列表 Chisguare檢驗(yàn) 。顯著性水準(zhǔn) α=。 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 EphA2mRNA及蛋白表達(dá)與大腸腺癌的關(guān)系：免疫組化結(jié)果 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 ? 免疫組化檢測(cè)結(jié)果： – EphA2蛋白定位于癌細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞及癌組織血管內(nèi)皮胞漿內(nèi)， 呈棕黃色。 – 陰性對(duì)照均無陽性顯示。 大腸腺 癌組織 及正常粘膜組織中EphA2蛋白的表達(dá) 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 正常粘膜 116() 6() 26（ ） 6（ ） 177。 腺 癌 12（ ） 32（ ） 48（ ） 62（ ） 177。 組別 EphA2蛋白表達(dá)（例數(shù) %） a 陽性細(xì)胞面積（ X177。 S)b 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) 一 . 大腸腺癌組織和正常粘膜組織中 EphA2蛋白表達(dá) 注： a:χ2=, P。b:χ2=, P 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 正常粘膜組織中 EphA2蛋白表達(dá) SP法 200 大腸腺癌組織中 EphA2蛋白表達(dá) SP法 200 來自 中國(guó)最大的資料庫(kù)下載 二