【正文】 罐已滅菌的含有苯乙酸前體的培養(yǎng)基中 ,通入無(wú)菌空氣 ,攪拌 ,在 27℃下培養(yǎng) 7天。在發(fā)酵過(guò)程中需補(bǔ)入苯乙酸前體及適量的培養(yǎng)基。②提取精制 :將青霉素發(fā)酵液冷卻 ,過(guò)濾。濾液在 pH2~ 的條件下 ,于萃取機(jī)內(nèi)用醋酸丁酯進(jìn)行多級(jí)逆流萃取 ,得到丁酯萃取液 ,轉(zhuǎn)入 ~ 的緩沖液中 ,然后再轉(zhuǎn)入丁酯中 ,將此丁酯萃取液經(jīng)活性炭脫色 ,加入成鹽劑 ,經(jīng)共沸蒸餾即可得青霉素 G 鉀鹽。青霉素 G鈉鹽是將青霉素 G 鉀鹽通過(guò)離子交換樹(shù)脂 (鈉型 )而制得 本次是針對(duì)天然青霉素的發(fā)酵部分設(shè)計(jì)的。 產(chǎn)青霉素的菌株分為球狀菌和絲狀菌。工業(yè)生產(chǎn)中主要用的菌株是產(chǎn)黃青霉 (Penicillium chrosogenum),孢子有綠色與黃色 ,菌落平坦或皺褶 ,圓形。青霉穗是分生孢子鏈狀的 ,深層培養(yǎng)菌絲分為球狀和絲狀兩種。大部分發(fā)酵是絲狀菌發(fā)酵。 2 青霉素發(fā)酵工藝流程 青霉素 發(fā)酵工藝流程路線(xiàn) 它們的發(fā)酵工藝流程有所不同 : A:絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程 冷凍管 (25176。 C,孢子培養(yǎng) ,7 天 )??斜面母瓶 (25176。 C,孢子培養(yǎng) ,7 天 )??大米孢子 (26176。 C,種子培養(yǎng) 56h,1:)??一級(jí)種子培養(yǎng)液 (27176。C, 種 子 培 養(yǎng) ,24h,1:)?? 二 級(jí) 種 子 培 養(yǎng) 液 (27~26 176。 C, 發(fā)酵 ,7天 ,1:)??發(fā)酵液。 B:球狀菌二級(jí)發(fā)酵工藝流程 冷凍管 (25176。 C,孢子培養(yǎng) ,6~8 天 )??親米 (25176。 C,孢子培養(yǎng) ,8~10 天 )??生產(chǎn)米 (28176。 C,孢子培養(yǎng) ,56~60h,1:)??種子培養(yǎng)液 (26~2524176。 C,發(fā)酵 ,7 天 ,1:)??發(fā)酵液。 培養(yǎng)基的特點(diǎn) 培養(yǎng)基中各成分特點(diǎn) 碳源的選擇 生產(chǎn)菌能利用多種碳源 ,乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂。從經(jīng)濟(jì)核算角度 ,生產(chǎn)成本中碳源占 12%以上 ,對(duì)工藝影響很大。糖與 6?APA 結(jié)合形成糖基 ?6?APA,影響青霉素的產(chǎn)量。葡萄糖、乳糖結(jié)合能力強(qiáng) ,而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。發(fā)酵初期 ,利用快效的葡萄糖進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)葡萄糖耗盡后 ,利用緩效的乳糖 ,使 PH 穩(wěn)定 ,分泌青霉素。目前采用淀粉的酶水解產(chǎn)物 ,葡萄糖化液流加 ,而不是流加葡萄糖 ,以降低成本。 氮源的選擇 玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)時(shí)的副產(chǎn)品 ,是最好的氮源 ,含有各種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。但玉米漿質(zhì)量不穩(wěn)定 ,可用花生粉餅或用棉子餅粉代替。 無(wú)機(jī)鹽 包括硫、磷、鎂、鉀等。鐵有毒 ,控制在 30μ g/ml 以下。 流加控制 根據(jù)殘液 PH、尾氣中 CO2 和 O2 的含量 ,殘?zhí)窃?%左右 ,PH 開(kāi)始升高時(shí)加糖。流加硫酸銨、氨水、尿素進(jìn)行補(bǔ)氮 ,控制氨基氮 %。 添加前體 不加側(cè)鏈前體時(shí) ,青霉素生產(chǎn)多種青霉素混合物。因此在合成階段 ,添加苯乙酸及其衍生物前體 ,苯乙酰氨、苯乙氨、苯乙酰甘氨酸等均可為青霉素側(cè)鏈的前體 ,直接摻入青霉素分子中 ,具有刺激青霉素合成的作用。但濃度大于 %時(shí)對(duì)細(xì)胞和合成有毒性 ,還能被細(xì)胞氧化。需要低濃度流加前體 ,一次加入量低于%,保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。發(fā)酵過(guò)程中采用補(bǔ)料分批操作法 ,對(duì)葡萄糖、銨、苯乙酸進(jìn)行緩慢流加 ,維持一定的最適濃度。葡萄糖的流加 ,波動(dòng)范圍較窄 ,濃度過(guò)低使抗生素合成速率減慢或停止。過(guò)高則導(dǎo)致呼吸活性下降 ,甚至 引起自溶 ,葡萄糖濃度調(diào)節(jié)是根據(jù) PH、溶氧量或 CO2 釋放率予以調(diào)節(jié)。 培養(yǎng)基種類(lèi)特點(diǎn) 發(fā)酵工藝中 ,按菌種生長(zhǎng)環(huán)境順序 ,培養(yǎng)基有 : A:孢子培養(yǎng)基 :甘油、葡萄糖、蛋白胨。 B:米孢子培養(yǎng)基 :優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基。 C:一級(jí)種子發(fā)酵罐 :葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣、玉米油、消泡劑等。 D:二級(jí)種子發(fā)酵罐 :玉米漿、蛋白質(zhì)等。 菌種生長(zhǎng) 產(chǎn)青霉菌的菌種在發(fā)酵條件下 ,深層培養(yǎng) ,經(jīng)歷了 7 個(gè)不同時(shí)期 ,每個(gè)時(shí)期有其菌體形態(tài)特征。在規(guī)定時(shí)間取樣 ,通過(guò)顯微鏡檢查 (生產(chǎn)上習(xí)慣稱(chēng)為鏡檢 )這些形態(tài)變 化 ,用于過(guò)程控制。 第一期 :分生孢子萌發(fā) ,形成芽管 ,原生質(zhì)未分化 ,具有小泡。 第二期 :菌絲繁殖 ,原生質(zhì)體具有嗜堿性 ,類(lèi)脂肪小顆粒。 第三期 :形成脂肪包涵體 ,累積儲(chǔ)藏物 ,沒(méi)有空泡 ,嗜堿性強(qiáng)。 第四期 :脂肪包涵體形成小滴并減少 ,中小空泡 ,原生質(zhì)體嗜堿性減弱 ,開(kāi)始產(chǎn)生抗生素。 第五期 :形成大空泡 ,有中性染色大顆粒 ,菌絲成桶狀 ,脂肪包涵體消失 ,青霉素產(chǎn)量最高。 第六期 :出現(xiàn)個(gè)別自溶細(xì)胞 ,細(xì)胞內(nèi)無(wú)顆粒 ,仍然桶狀 ,釋放游離氨 ,PH上升。 第七期 :菌絲完全自溶 ,僅有 空細(xì)胞壁。 1~4 期為菌絲生長(zhǎng)期 ,3 期的菌體適宜為種子。 4~5 期為生產(chǎn)期生產(chǎn)能力最強(qiáng) ,通過(guò)工藝措施 ,延長(zhǎng)此期 ,獲得高產(chǎn)。在第六期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。 主要設(shè)備工藝流程框圖 在工藝路線(xiàn)和生產(chǎn)方法確定之后 ,物料衡算開(kāi)始之前表示生產(chǎn)工藝過(guò)程的一種定性圖紙 ,詳見(jiàn)附圖。 3 工藝控制及要點(diǎn) 工藝控制 影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素 基質(zhì)濃度在分批發(fā)酵中 ,常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過(guò)高 ,對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏 (或抑制 )或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制 (如葡萄糖和錢(qián)的阻遏或抑制 ,苯乙酸的生 長(zhǎng)抑制 ),而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成 ,為了避免這一現(xiàn)象 ,在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 ,即對(duì)容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 ,因?yàn)榧词故浅鲎钸m濃度范圍較小的波動(dòng) ,都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制 ,使生物合成速度減慢或停止。目前 ,糖濃度的檢測(cè)尚難在線(xiàn)進(jìn)行 ,故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 ,而是間接根據(jù) pH 值、溶氧或 C02 釋放率予以調(diào)節(jié)。 溫度 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別 ,但一般認(rèn)為應(yīng)在 25 176。 C 左右。溫度過(guò)高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率 ,同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗 ,降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長(zhǎng)和青霉素合成來(lái)說(shuō) ,最適溫度不是一樣的 ,一般前者略高于后者 ,故有的發(fā)酵過(guò)程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度 ,以縮短生長(zhǎng)時(shí)間 ,到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 ,以利于青霉素的合成。 pH 值 青霉素發(fā)酵的最適 pH值一般認(rèn)為在 ,有時(shí)也可以略高或略低一些 ,但應(yīng)盡量避免 pH值超過(guò) ,因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定 ,容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中 ,pH 值的變化是葡萄糖流加速度 高低的反映。過(guò)高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使 pH 值降低 。過(guò)低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 pH 值上升。 溶解氧 對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來(lái)說(shuō) ,溶氧濃度是影響發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降 30%飽和度以下時(shí) ,青霉素產(chǎn)率急劇下降 ,低于 10%飽和度時(shí) ,則造成不可逆的損害。溶氧濃度過(guò)高 ,說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過(guò)低 ,造成呼吸強(qiáng)度下降 ,同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn) ,而氧消耗與碳能源消耗成正比 ,故溶氧 濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個(gè)參考指標(biāo)。 消沫 發(fā)酵過(guò)程泡沫較多 ,需要加入消沫劑 ,天然油脂如玉米油 ,化學(xué)消沫劑如泡敵。少量多次 ,不適在前期多加入 ,影響呼吸代謝。 菌絲濃度 發(fā)酵過(guò)程中必須控制菌絲濃度不超過(guò)臨界菌體濃度 ,從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達(dá)到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強(qiáng)度取決于維持因數(shù)的大小 ,維持因數(shù)越大 ,呼吸強(qiáng)度越高、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強(qiáng)度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率 ,而通氣與攪拌能力強(qiáng)的發(fā)酵 罐及黏度低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升 ,從而提高臨界菌體濃度。 菌絲生長(zhǎng)速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)證明 ,在葡萄糖限制生長(zhǎng)的條件下 ,青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長(zhǎng)速率之間呈現(xiàn)一定的關(guān)系。當(dāng)比生長(zhǎng)速率低