農(nóng)產(chǎn)品分析3-2-文庫(kù)吧
2025-02-19 13:53 本頁(yè)面
【正文】 成，必須經(jīng)酸水解把蛋白質(zhì)完全變成游離氨基酸后才能上柱分析 。蛋白質(zhì)中的 胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸 在酸水解條件下不穩(wěn)定， 需采用另外的處理方法，即 胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸首先在控制條件下用過(guò)甲酸氧化 ， 使它們轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)酸穩(wěn)定的氧化物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜， 然后 再用鹽酸水解法 從蛋白質(zhì)中分離出來(lái) . 色氨酸則采用堿水解法 從蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。樣品分析? 把經(jīng)處理后的樣品上柱分析，上柱的樣品量視自動(dòng)分析儀的靈敏度而定。一般為每種氨基酸 右 (水解樣品干重約 )。? 根據(jù)峰出現(xiàn)的時(shí)間來(lái)確定氨基酸的種類， 從峰的高度和寬度可算出各種氨基酸的精確含量 。 實(shí)驗(yàn)條件? 實(shí)驗(yàn)儀器 :HITACHI83550型高速氨基酸自動(dòng)分析儀? 色譜條件 :色譜柱 :150mm。 柱溫 :53℃。? 流速 :。? 測(cè)定條件：必須在 pH5～ ， 100℃ 下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間為 10～15min，生成的紫色物質(zhì)在 570nm下進(jìn)行比色測(cè)定。其生成的黃色化合物在 440nm下進(jìn)行比色測(cè)定。? 樣品中氨基酸的濃度 83550型號(hào)氨基酸分析儀器的氨基酸適宜濃度為 110nmol/50ml，脯氨酸 6nmol／ 50ml。? 緩沖液的 pH與 Na+濃度 溶液的 pH值和鈉離子濃度對(duì)氨基酸的分離有很大關(guān)系，配制不當(dāng)會(huì)影響峰的位置，甚至?xí)箓€(gè)別氨基酸丟失，因此應(yīng)特別精心配制。? 柱溫氨基酸的分離與柱溫有關(guān) 835型氨基酸分析儀柱溫規(guī)定 53℃.? 樹(shù)脂的污染 污染的樹(shù)脂也會(huì)使分辨率降低。微生物、蛋白質(zhì)污染（游離氨基酸樣品）、金屬離子污染、油膩污染等。? 除氨 在色譜柱前附加一 除氨柱 ，除去緩沖液、試樣或流路系統(tǒng)中混入的氨，防止氨在分離過(guò)程中被洗脫下來(lái)。因此，除氨柱可重復(fù)連續(xù)使用。? 茚三酮的氧化 茚三酮很易氧化，氧化后顯色效率降低，甚至變質(zhì)失效。因此，除注意 N2氣保護(hù)外，茚三酮試劑不可過(guò)量配制和長(zhǎng)期使用 。 ? 柱層析的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 是磺酸型強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（苯乙烯 二乙烯基苯）。? 定量測(cè)定的依據(jù) 是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成 紫色化合物 。而 脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物。? 用離子交換柱層析測(cè)定的氨基酸圖譜如圖 11， 2所示178。出峰的時(shí)間順序：? 天冬氨酸（ Asp）、蘇氨酸 **（ Thr）、絲氨酸（ Ser）、谷氨酸（ Glu） ? 甘氨酸（ Gly）、丙氨酸（ Ala）、半胱氨酸（ Cys）、色氨酸 **（ Trp）、纈氨酸 **(Val)? 蛋氨酸 **（ Met）、異亮氨酸 **（ Ile）、亮氨酸 **（ Leu）、酪氨酸（ Tyr）、苯丙氨酸 **（ Phe） ? 賴氨酸 **（ Lys）、 NH組氨酸（ His）、精氨酸（ Arg） **為必需氨基酸 ? 氨基酸總量 (氨態(tài)氮 )的測(cè)定178。單指示劑甲醛滴定法 ? 方法原理： 氨基酸具有酸、堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被岷?COOH基顯示酸性，又含有 NH2基顯示堿性。由于這二個(gè)基的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)， NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來(lái)滴定 COOH基，以間接方法測(cè)定氨基酸的量，反應(yīng)式可能以下面三種形式存在。 試劑 40％ 中性甲醛溶液，以麝香草酚酞為指示劑，用 1MNaOH溶液中和。 ％ 麝香草酚酞乙醇溶液。 。操作步驟 ： 稱取一定量樣品 (約含 20毫克左右的氨基酸 )于燒杯中 (如為固體加水 50毫升 )，加 23滴指示劑，用 NaOH溶液滴定至淡藍(lán)色。加入中性甲醛 20毫升，搖勻，靜置 1分鐘，此時(shí)藍(lán)色應(yīng)消失。再用 NaOH溶液滴定至淡藍(lán)色。記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)，用下述公式計(jì)算計(jì)算：氨基酸態(tài)氮 (％ ) = ( NV100) / W式中： N： NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液當(dāng)量濃度。 V： NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的總量 (m1) W：樣品溶液相當(dāng)樣品重量 (克 )。 ：氮的毫克當(dāng)量。? 雙指示劑甲醛滴定法 ? 方法原理：與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑。從分析結(jié)果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮?dú)馊萘糠?(此法操作復(fù)雜，不作介紹 )相近，單色滴定法稍偏低，主要因?yàn)閱沃甘緞┘兹┑味ǚㄊ且园被崛芤?PH值作為 麝香草酚酞的終點(diǎn)。 PH值在 ，而雙指示劑是以氨基酸溶液的 PH值作為中性紅的終點(diǎn)， PH值為 ，從理論計(jì)算看，雙色滴定法較為準(zhǔn)確。 試劑：三種試劑同單指示劑法 ％中性紅 (50％乙醇溶液 ) 操作步驟： 取相同的兩份樣品，分
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