分子生物學(xué)基本技術(shù) —pcr (polymerase chain reaction)-文庫(kù)吧
2024-12-22 03:23 本頁(yè)面
【正文】 反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生 退火 ，再將溫度升高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以 延伸 。 這種熱變性 復(fù)性 延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)， PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 回憶： DNA 的復(fù)制 …… DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長(zhǎng) ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解鏈酶 回憶： DNA 的復(fù)制 …… RNA引物 RNA引物 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 引物酶 引物酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長(zhǎng) 回憶： DNA 的復(fù)制 …… ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長(zhǎng) TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 回憶： DNA 的復(fù)制 …… 變變變變變變90變95變40變60變70變75變PCR簡(jiǎn)要過(guò)程圖解 PCR詳細(xì)過(guò)程圖解 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時(shí)間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬(wàn)倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 模板 DNA 95℃ 1 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 2 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃ Taq酶 Taq酶 3 第 1輪結(jié)束 95℃ 第 2輪開(kāi)始 4 72℃ Taq Taq Taq Taq 5 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過(guò)程 ? PCR的特點(diǎn) 模板 DNA 第 1輪擴(kuò)增 第 2輪擴(kuò)增 第 3輪擴(kuò)增 第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增 第 6輪擴(kuò)增 三、 Primer design引物常規(guī)設(shè)計(jì)原則 1. 長(zhǎng)度： 1537 nt, 一般 20nt左右 。 (僅 binding , 不含接頭 ) 2. G + C 含量 40％～ 60％，而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。 3. 避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)； 4. 引物自身不能互補(bǔ)（ 3個(gè)） 5. 引物之間不能互補(bǔ)（ 5 個(gè)） 6. 引物３端不能錯(cuò)配 , 不能修飾，盡量不用 T, 不能超過(guò)３個(gè)連續(xù)的 G或 C； 7. ５端可變化修飾，附加酶切位點(diǎn)； 8. 兩引物的 Tm值應(yīng)比較接近； 9. 正鏈引物： mRNA序列照抄； 負(fù)鏈引物：先寫(xiě)出 mRNA序列的互補(bǔ)序列，然后翻轉(zhuǎn)重寫(xiě)。 10．解鏈溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) [ =20 nt ] Tm = +*(GC%
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