11酶工程酶的蛋白質(zhì)工程-文庫吧
2025-08-01 02:05 本頁面
【正文】 特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外對基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。 定向進(jìn)化技術(shù) 定向進(jìn)化＝隨機(jī)突變＋選擇 定向進(jìn)化的原理 體外定向進(jìn)化的意義 ? 理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。 ? 所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實驗分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制 (隨機(jī)突變、重組和自然選擇 )，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。 ? 酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。 酶分子定向進(jìn)化技術(shù)的關(guān)鍵 ? 定向進(jìn)化是一個由構(gòu)建突變體庫，突變體表達(dá)，表達(dá)后篩選三個步驟組成的循環(huán)遞進(jìn)過程，需要： ? (1) 產(chǎn)生包含大量帶有微量有利突變的突變體的文庫 。 ? (2) 突變體應(yīng)能在適當(dāng)?shù)奈⑸?(如大腸桿菌或酵母菌 ) 體內(nèi)進(jìn)行功能的表達(dá) 。 ? (3) 必須有一種靈敏的篩選方法 ,能反映出由一個氨基酸的置換而引起的預(yù)期性狀的較小提高。 隨機(jī)突變的策略 ?易錯 PCR技術(shù) (errorprone PCR) ?DNA改組 (DNA shuflling)：由美國 Stemmer 于 1994 年首次提出 一項體外重組技術(shù) ?隨機(jī)引發(fā)重組 (RPR) 1998 年 ,Arnold 提出了一種有效的新方法 ?交錯延伸技術(shù) (StEP)：由 Zhao 等提出 , 是一種簡化的 DNA shuffling 技術(shù) 易錯 PCR ?易錯 PCR（ error prone PCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時引入 堿基錯配 ，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。 ?連續(xù)易錯 PCR (sequential error prone PCR)策略。即將一次 PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次 PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。 DNA改組和外顯子改組 ? DNA改組 (DNA shuffling)又稱有性 PCR (sexual PCR)，原理如圖所示。 ? 外顯子改組 (exon shuffling）類似于 DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而 DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。 體外隨機(jī)引發(fā)重組 體外隨機(jī)引發(fā)重組 (random priming in vitro rebination, RPR)以 單鏈 DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點的短 DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短 DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們 互為引物 進(jìn)行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。 交錯延伸 交錯延伸 (stagger extension process, StEP) 在 PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步 , 縮短其反應(yīng)時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長度。 基因突變庫的篩選方法 ? 活體篩選法 遺傳互補(bǔ)篩選法 ? 活體 離體篩選法 噬菌體展示法；細(xì)胞表面展示法（細(xì)菌、纖毛蟲細(xì)胞、酵母等） ? 離體篩選法 1）核糖體顯示技術(shù) 2） RNA蛋白質(zhì)融合技術(shù) (RNA顯示技術(shù)） 定向進(jìn)化的篩選策略 ? 瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 ? 微孔板懸浮法 在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到 96孔板上檢測吸光度。使用微流控芯片。 ? 微球細(xì)胞固定法 與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合，將單個細(xì)胞附著在單個固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。 ? 流式細(xì)胞計數(shù)法 細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行測定。 突變體分離 突變酶分子的高通量篩選策略 檢測培養(yǎng)基篩選法 ? 通常是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥物，使培養(yǎng)后發(fā)生某種可以辨別的變化，如培養(yǎng)基的透明度的變化或菌落周圍顏色的變化，由此區(qū)別不同類型或生理特性不同的微生物。這種篩選可以在檢測平板中進(jìn)行，也可以在微孔滴定板中進(jìn)行，借助一些檢測儀器很容易實現(xiàn)高通量篩選。 基于比色法和熒光檢測的高通量篩選 基于檢測培養(yǎng)基篩選法的，生色基團(tuán)或熒光基團(tuán)的底物參加的催化反應(yīng)是最容易實現(xiàn)高通量篩選的。 ? 通過監(jiān)測反應(yīng)過程中的顏色和熒光的變化可以有效地監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)行。 ? 使用比色計或熒光計檢測顯色或熒光底物， pH指示劑顯色反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移還可以實現(xiàn)高通量實時檢測
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