11酶工程酶的蛋白質工程-文庫吧
2025-08-01 02:05 本頁面
【正文】 特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對基因進行隨機突變，從一個或多個已經存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經過基因的突變和重組，構建一個人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預先期望的具有某些特性的進化酶。 定向進化技術 定向進化＝隨機突變＋選擇 定向進化的原理 體外定向進化的意義 ? 理論上，蛋白質分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。 ? 所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結構和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制 (隨機突變、重組和自然選擇 )，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質的突變酶。 ? 酶的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決合理設計所不能解決的問題，為酶的結構與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農業(yè)和醫(yī)藥等領域逐漸顯示其生命力。 酶分子定向進化技術的關鍵 ? 定向進化是一個由構建突變體庫，突變體表達，表達后篩選三個步驟組成的循環(huán)遞進過程，需要： ? (1) 產生包含大量帶有微量有利突變的突變體的文庫 。 ? (2) 突變體應能在適當?shù)奈⑸?(如大腸桿菌或酵母菌 ) 體內進行功能的表達 。 ? (3) 必須有一種靈敏的篩選方法 ,能反映出由一個氨基酸的置換而引起的預期性狀的較小提高。 隨機突變的策略 ?易錯 PCR技術 (errorprone PCR) ?DNA改組 (DNA shuflling)：由美國 Stemmer 于 1994 年首次提出 一項體外重組技術 ?隨機引發(fā)重組 (RPR) 1998 年 ,Arnold 提出了一種有效的新方法 ?交錯延伸技術 (StEP)：由 Zhao 等提出 , 是一種簡化的 DNA shuffling 技術 易錯 PCR ?易錯 PCR（ error prone PCR）是指在擴增目的基因的同時引入 堿基錯配 ，導致目的基因隨機突變。 ?連續(xù)易錯 PCR (sequential error prone PCR)策略。即將一次 PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次 PCR擴增的模板，連續(xù)反復地進行隨機誘變。 DNA改組和外顯子改組 ? DNA改組 (DNA shuffling)又稱有性 PCR (sexual PCR)，原理如圖所示。 ? 外顯子改組 (exon shuffling）類似于 DNA改組，與但與其不同，它是靠同一種分子間內含子的同源性帶動，而 DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。 體外隨機引發(fā)重組 體外隨機引發(fā)重組 (random priming in vitro rebination, RPR)以 單鏈 DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產生大量互補于模板不同位點的短 DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短 DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應中，它們 互為引物 進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。 交錯延伸 交錯延伸 (stagger extension process, StEP) 在 PCR反應中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步 , 縮短其反應時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經變性的新生鏈再作為引物與體系內同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復進行，直到產生完整的基因長度。 基因突變庫的篩選方法 ? 活體篩選法 遺傳互補篩選法 ? 活體 離體篩選法 噬菌體展示法；細胞表面展示法（細菌、纖毛蟲細胞、酵母等） ? 離體篩選法 1）核糖體顯示技術 2） RNA蛋白質融合技術 (RNA顯示技術） 定向進化的篩選策略 ? 瓊脂板涂布法 在特殊條件下培養(yǎng)突變菌，通過宿主菌的生長情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。 ? 微孔板懸浮法 在含生色底物平板上培養(yǎng)，挑取具有活性的克隆接種到 96孔板上檢測吸光度。使用微流控芯片。 ? 微球細胞固定法 與數(shù)字成像系統(tǒng)結合，將單個細胞附著在單個固體珠上，突變體進行分離和篩選。 ? 流式細胞計數(shù)法 細胞經熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，排成單行，逐個通過流式細胞計數(shù)儀進行測定。 突變體分離 突變酶分子的高通量篩選策略 檢測培養(yǎng)基篩選法 ? 通常是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學藥物，使培養(yǎng)后發(fā)生某種可以辨別的變化，如培養(yǎng)基的透明度的變化或菌落周圍顏色的變化，由此區(qū)別不同類型或生理特性不同的微生物。這種篩選可以在檢測平板中進行，也可以在微孔滴定板中進行，借助一些檢測儀器很容易實現(xiàn)高通量篩選。 基于比色法和熒光檢測的高通量篩選 基于檢測培養(yǎng)基篩選法的，生色基團或熒光基團的底物參加的催化反應是最容易實現(xiàn)高通量篩選的。 ? 通過監(jiān)測反應過程中的顏色和熒光的變化可以有效地監(jiān)測反應的進行。 ? 使用比色計或熒光計檢測顯色或熒光底物， pH指示劑顯色反應和熒光共振能量轉移還可以實現(xiàn)高通量實時檢測
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