3-第三章-文庫吧
2025-07-20 08:44 本頁面
【正文】 L2后細(xì)胞微絲骨架的熒光觀察 對照組 ⑴ 原理 : 熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞的抗原進(jìn)行反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察到明亮的特異熒光。 ⑵熒光素標(biāo)記抗體的方法 ①直接法：熒光素直接和第一抗體偶聯(lián)。 ②間接法：熒光素先和第二抗體 (抗第一抗體的抗體 )偶聯(lián)，再與第一抗體作用。 4. 免疫熒光顯微鏡技術(shù) （ Immunofluorescence microscopy） ⑴ 發(fā)光原理 : 藍(lán)色光 GFP 綠色熒光 ⑵ 特點 : 可在光鏡水平 ， 對特異蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行定位及顯示一些細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 。 ⑶ 應(yīng)用 : 5. 綠色熒光蛋白 green fluorescent protein GFP 載體 (GFP基因＋待定位蛋白基因 ) 導(dǎo)入特定的細(xì)胞 熒光顯微鏡下觀察 待定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的位置分布 特異蛋白質(zhì)生物大分子定位 觀察過氧化物酶體 GFP ＋過氧化物體內(nèi)的酶（有定位信號） 導(dǎo)入不同細(xì)胞 熒光顯微鏡下觀察各種細(xì)胞的過氧化物酶體 （三）激光共聚焦掃描顯微鏡 （ Laser confocal scanning microscope, LCSM） 顯微 CT 激光作掃描光源 掃描焦平面上樣品，得樣品切面像 載物臺上微量步進(jìn)馬達(dá)使載物臺上下移動 ,改變焦平面 得不同層次的切面圖像 計算機圖像三維重組獲樣品立體圖像 分辨率：因激光束波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨率，約是普通光鏡的 3倍。 應(yīng)用： 觀察細(xì)胞形態(tài) 統(tǒng)計光密度來定量細(xì)胞內(nèi)成分 三維重建 （四）相差顯微鏡 1. 1953年諾貝爾物理獎 2. 特點 : 可用以觀察活細(xì)胞。 3. 原理 : 波長 顏色 振幅 亮度 速度 相位 ⑴ 普通顯微鏡 : 光通過染色標(biāo)本時，波長和振幅發(fā)生變化，人眼才能觀察到。但光通過活細(xì)胞時，波長和振幅幾乎無改變，這就無法用人眼觀察。 ⑵相差顯微鏡 細(xì)胞內(nèi)的各結(jié)構(gòu)可 因密度不同 而產(chǎn)生相位差 (即光程差 )，不過人眼無法鑒別這種微小的變化。相差顯微鏡能夠把這種 “相位差” 變成 “振幅差” ，即圖像的明暗差。 通過致密部分 (如細(xì)胞核 ),速度慢 通過疏松部位 (如細(xì)胞質(zhì) ),速度快 相位差 (光程差 ) 振幅差 (明暗差 ) 相差顯微鏡 倒置相差顯微鏡 載物臺的上方： 光源 長焦距 聚光器 載物臺的下方： 物鏡 應(yīng)用：直接對培養(yǎng)的 細(xì)胞進(jìn)行觀察 培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞 活細(xì)胞的有絲分裂 在日常生活中，室內(nèi)飛揚的微粒塵土是不易被看見的，但在暗的房間中若有一束從光線從門縫斜射過來，灰塵便粒粒可見了，這是光學(xué)上的 丁達(dá)爾現(xiàn)象 。 —— 制造暗視野顯微鏡的靈感 （五）暗視野顯微鏡 原理 : 利用特殊裝置使照射光斜照到樣品上，照射光無法進(jìn)入物鏡，故呈暗視野。只有從樣品發(fā)出的散射光才能進(jìn)入物鏡被放大 ,在暗的背景中呈現(xiàn)明亮的像。 分辨率： 典型的動物細(xì)胞 ——— 10～ 20 ?m 一般的細(xì)菌和線粒體 —— ?m (500nm) 普通顯微鏡 ———— (200nm) 暗視野顯微鏡 ———— (4200nm) 應(yīng)用： 能觀察物體輪廓 ,分不清內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)。用以觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體 , 以及液體介質(zhì)中的細(xì)菌等微粒的運動 。 顯微電影攝影 —記錄細(xì)胞或細(xì)胞器運動過程和速度 用顯微電影攝影術(shù)或電視錄像以一定間隔拍攝一次細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)影片或電視錄像以正常速度反映時，所拍攝的情節(jié)就被大大加快了，用這種方法可以準(zhǔn)確地記錄細(xì)胞或細(xì)胞其的運動過程和速度。 （六）微分干涉顯微鏡 A普通明視場顯微鏡； B相差顯微鏡； C微分干涉顯微鏡 微分干涉顯微鏡以平面偏振光為光源 。光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光會合，從而樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且極有很強立體感，適于研究細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理圖 （七）熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（ FRET） （八）熒光漂白恢復(fù)技術(shù) (FRAP) 熒光漂白恢復(fù)技術(shù)原理圖 二、電子顯微鏡 （一）透射電子顯微鏡 （ transmission electron microscope, TEM） 1. 原理 ◆ 以電子束作光源，電磁場作透鏡 。電子束波長短，且波長與加速電壓 (通常為 50~120KV)的平方根成反比。 ◆由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等 5部分構(gòu)成。 分辨力 ，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。 ◆用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ ultrastructure），即小于 、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)， 又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（
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