3-第三章-文庫吧資料
2024-08-17 08:44本頁面
【正文】 TdR來顯示 DNA，用 3HUdR顯示 RNA；用 3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、 3H巖藻糖研究多糖。 原理： 將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 5. 茚三酮反應(yīng) ：顯示蛋白質(zhì)。 3. 聯(lián)苯胺反應(yīng) ：過氧化物酶分解 H202，產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。 2. Schiff反應(yīng)：細(xì)胞中的醛基可使 Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。 （一）固定 1. 物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。 2）所需的力場通常比速率沉降法大 10～ 100倍，往往需要高速或超速離心。 原理： 樣品各成分在 連續(xù)梯度的介質(zhì) 中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的成分分離。 特點 ：介質(zhì)密度較低， 介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度 。 速度沉降 velocity sedimentation 用途 ：分離 密度相近而大小不等 的細(xì)胞或細(xì)胞器。 常用介質(zhì)： 氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 （二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。 沉降順序： 核 →線粒體 →溶酶體與過氧化物酶體 →內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體 →核蛋白體。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點： ——介質(zhì)密度均一； ——速度由低向高，逐級離心。 轉(zhuǎn)速 25kr/min，離心力 89Kｇ 者稱為 超速離心機 。 第二節(jié) 細(xì)胞組分的分離及分析技術(shù) 一、細(xì)胞組分的分離 ——離心技術(shù) 是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段 。 分辨率： 橫向為 ~，縱向可達(dá) 。 Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For parison, the same structure is shown by differentialinterferencecontrast light microscopy (B) and by thinsection electron microscopy (C). 蛙的內(nèi)耳毛細(xì)胞 （三）掃描隧道顯微鏡 （ scanning tunneling microscope， STM） 原理： 根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計，當(dāng)原子尺度的針尖在一定高度（ 100nm以內(nèi)）上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（ 2mV~2V），針尖與樣品之間形成 隧道電流 。聚焦電子束與試樣相互作用，產(chǎn)生二次電子發(fā)射。 隨樣品表面結(jié)構(gòu)的高低起伏，重金屬形成不同厚度的薄膜，顯示了投影效果，給出了一個樣品表面結(jié)構(gòu)的三維圖像。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。 （ 1）負(fù)染技術(shù) 冰凍蝕刻 freezeetching 標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。 應(yīng)用： 適用于顆?；蚶w維等游離的樣品。重金屬浸染。約為細(xì)胞的 1/200厚度。 (4)包埋 ：為使柔軟生物組織制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊，應(yīng)在切片前將標(biāo)本進(jìn)行包埋 ,常用 環(huán)氧樹脂 。 (3)脫水 ：標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察 ,所以電鏡生物標(biāo)本不能含水。 戊二醛：在蛋白質(zhì)分子之間形成共價鍵 , 將它們交聯(lián)在一起。 由于散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的部分散射電子少而形成明區(qū)。 ◆用于觀察超微結(jié)構(gòu)（ ultrastructure），即小于 、光學(xué)顯微鏡下無法看清的結(jié)構(gòu)， 又稱亞顯微結(jié)構(gòu)（ submicroscopic structures）。 ◆由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等 5部分構(gòu)成。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理圖 （七）熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（ FRET） （八）熒光漂白恢復(fù)技術(shù) (FRAP) 熒光漂白恢復(fù)技術(shù)原理圖 二、電子顯微鏡 （一）透射電子顯微鏡 （ transmission electron microscope, TEM） 1. 原理 ◆ 以電子束作光源，電磁場作透鏡 。 （六）微分干涉顯微鏡 A普通明視場顯微鏡； B相差顯微鏡； C微分干涉顯微鏡 微分干涉顯微鏡以平面偏振光為光源 。用以觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體 , 以及液體介質(zhì)中的細(xì)菌等微粒的運動 。只有從樣品發(fā)出的散射光才能進(jìn)入物鏡被放大 ,在暗的背景中呈現(xiàn)明亮的像。 通過致密部分 (如細(xì)胞核 ),速度慢 通過疏松部位 (如細(xì)胞質(zhì) ),速度快 相位差 (光程差 ) 振幅差 (明暗差 ) 相差顯微鏡 倒置相差顯微鏡 載物臺的上方： 光源 長焦距 聚光器 載物臺的下方： 物鏡 應(yīng)用：直接對培養(yǎng)的 細(xì)胞進(jìn)行觀察 培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞 活細(xì)胞的有絲分裂
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