【正文】 rain barrier (BBB)。 Coumarin6。 Biodegradable nanoparticle。 Brain delivery 血腦屏障（BBB）在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受外源性毒物損傷的同時(shí)也限制了大多數(shù)神經(jīng)治療藥物入腦，成為腦部疾病治療的最大障礙[1]。大約98%的小分子藥物和幾乎100%的大分子藥物，包括酶，基因和siRNAs等均不能透過BBB[2]。隨著現(xiàn)今腦部疾病發(fā)病率的不斷升高，通過各種給藥系統(tǒng)和靶向策略增加藥物的腦內(nèi)傳遞已成為解決這一問題的關(guān)鍵。局部侵入給藥（腦內(nèi)直接注射/滴注）易引發(fā)感染，手術(shù)費(fèi)用高且有效遞藥面積有限[3]。而非侵入給藥借助BBB上存在的內(nèi)源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可以避免破壞血腦屏障并實(shí)現(xiàn)廣泛的全腦遞藥[4]。在各種非侵入給藥方式中，利用在BBB上存在特異受體的靶向頭基連接載藥系統(tǒng)得到的受體介導(dǎo)的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)在具有腦靶向功能的同時(shí)能夠提高藥物包封率，降低副作用和避免多藥耐藥系統(tǒng)的外排，具有很好的前景[5]。目前最具代表性的受體介導(dǎo)腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)OX–26結(jié)合的免疫脂質(zhì)體成功用于小分子藥物及基因藥物的腦內(nèi)遞送，證實(shí)了受體介導(dǎo)途徑優(yōu)良的腦內(nèi)遞藥能力[6, 7]。然而，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差及單克隆抗體效果的不穩(wěn)定限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[810]。因此，腦部疾病的治療仍需開發(fā)新型的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)。乳鐵蛋白是一種陽離子鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，它由690個(gè)氨基酸折疊而成兩個(gè)球形裂片，各包含一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)。Lf具有抗炎，免疫調(diào)節(jié)，抗菌及抗癌等多種生理功能[11]?，F(xiàn)已證明多種生物BBB表面均存在Lf受體（LfR），能夠介導(dǎo)Lf轉(zhuǎn)運(yùn)[1214]。最近, Ji等人比較了Tf，OX26和Lf的入腦性能，結(jié)果證實(shí)Lf的入腦能力顯著高于前兩者[15]。本試驗(yàn)利用Lf的腦靶向能力構(gòu)建了受體介導(dǎo)的生物可降解腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)并探索了Lf作為腦靶向頭基的能力。采用聚乙二醇聚乳酸納米粒與Lf連接是基于納米粒相對(duì)于脂質(zhì)體的諸多優(yōu)點(diǎn)：具有較好的穩(wěn)定性，處方中輔料種類較少，制備相對(duì)簡(jiǎn)單，具有一定的緩釋能力便于慢性疾病的治療[16]。此外，聚乙二醇和聚乳酸都是FDA已批準(zhǔn)的輔料，將使載藥系統(tǒng)具有較好的生物相容性和安全性[17，18]。為了評(píng)價(jià)其腦內(nèi)遞藥特性，以香豆素6為熒光探針定性和定量地研究了小鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)LfNP和NP的攝取及它們?cè)谛∈竽X內(nèi)的分布,并通過細(xì)胞活力試驗(yàn)進(jìn)行了該系統(tǒng)體外毒性的評(píng)價(jià)。1. 儀器和材料JY92II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；R200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和B490恒溫水浴（Buchi，德國）； NICOMPTM 380 ZLS粒度/zeta電位測(cè)定儀（NICOMP，美國）；PHI 5000C X射線光電子能譜儀（ESCA system，美國）；CM 120透射電鏡（Philip，荷蘭）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，中國香港）；UFXDX倒置相差顯微鏡（Nikon，日本）；UFXII熒光顯微鏡（Nikon，日本）；LC10A RF10AXL高效液相色譜儀（Shimadzu，日本）。乳鐵蛋白（Sigma, 美國）；MPEG（Mr 3000，SUNBRIGHTTM MEH30H，NOF，日本）；MaleimidePEG（Mr 3400，NEKTAR，美國）；Traut’s試劑（Sigma，美國）；山羊抗Lf抗體（Bethyl，美國）；10 nm 膠體金標(biāo)記兔抗山羊IgG抗體（Sigma，美國）；Lf ELISA試劑盒（Bethyl，美國）；HiTrap脫鹽柱（Amersham Pharmacia Biotech AB，瑞典）；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（Gibco，美國）；熒光封片劑（Dako，美國）；香豆素6（Aldrich，德國）；CCK8（Dojindo Laboratories，日本）； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海申能博彩公司，中國）；昆明鼠（1820 g，♂，復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）。2. 實(shí)驗(yàn)方法 NP和LfNP的制備及表征馬來酰亞胺基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基聚乙二醇聚乳酸1：9混合以復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備NP [19]。Lf 與Traut’s試劑1：40反應(yīng)后以HiTrap脫鹽柱進(jìn)行純化。巰基化Lf與NP常溫下反應(yīng)9h制得LfNP。成初乳前有機(jī)相中加入香豆素6，制備載香豆素6的 NP和LfNP，以Sepharose CL4B除去未包封的香豆素6。采用透射電鏡技術(shù)（TEM）和動(dòng)態(tài)光散射分析（DLS）對(duì)LfNP和NP的形態(tài)，粒徑進(jìn)行表征。以免疫電鏡技術(shù)和X射線光電子能譜對(duì)LfNP表面連接的Lf進(jìn)行驗(yàn)證。ELISA測(cè)定LfNP表面Lf個(gè)數(shù)。考察載香豆素6的LfNP和NP在pH pH 。 LfNP腦內(nèi)遞藥特性和生物相容性的體外評(píng)價(jià) ，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1天。細(xì)胞用HBSS預(yù)先孵育15 min后，分別加入載香豆素6 LfNP和NP的HBSS溶液（15 μg/ml），37℃ h、1 h和2 h。棄去納米粒溶液，細(xì)胞用PBS沖洗三次，取出玻片放入4%多聚甲醛中于室溫固定20 min，用PBS漂洗3次后，用熒光封片劑封片，用相差及熒光顯微鏡觀察。將載有香豆素6的LfNP和NP稀釋成含1－60 μg/ml的納米粒供試液，按不同濃度每孔加入1 ml（空白孔加1 ml HBSS），分別放入37℃及4℃孵育1 h，考察細(xì)胞在4℃和37℃下對(duì)LfNP和NP的攝取情況。同時(shí)將載香豆素6的LfNP和NP分別以10 μg/ml的濃度加入培養(yǎng)孔中，放入37℃、2和4 h，考察在37℃下、。加入10 μg/ml LfNP和過量Lf（10 mg/ml）37℃孵育30min進(jìn)行攝取抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后，棄去納米粒溶液，細(xì)胞用1 ml冰冷的PBS終止攝取，再用PBS 1ml沖洗5次。用 1% TritonX 100 400 μl溶解細(xì)胞。采用HPLC法測(cè)定溶解液中香豆素6的濃度，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。分別加入樣品濃度為0－ mg/ml 的Lf、NP和LfNP的PBS溶液，37℃孵育4 h，溶液用110 μl 新鮮的培養(yǎng)液（含CCK8 10 μl）替換，37℃孵育4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)。以培養(yǎng)液為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞活力。 LfNP腦內(nèi)遞藥特性的體內(nèi)評(píng)價(jià)小鼠尾靜脈注射60 mg/kg載香豆素6的NP和LfNP， 1h后乙醚麻醉，心室灌注生理鹽水20 min，斷頭處死，取腦置4%多聚甲醛固定24h，蔗糖梯度脫水后于視交叉后1 cm處冠狀切腦組織，冰凍切片，厚度20 μm，PBS漂洗后用1 μg/ml DAPI染色10 min，PBS漂洗，用熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察納米粒在腦組織中的分布和熒光強(qiáng)度。54只小鼠平均分成2組，每組分別尾靜脈注射載香豆素6的LfNP和NP溶液（%和0. 71%） 60 mg/kg，，1，2，4，8，12和24 h摘眼球取血后處死，迅速取出大腦去除腦膜上的血管，稱重后20℃保存。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)采集3只小鼠樣品。樣品處理后以HPLC法分析血中和腦中的香豆素6含量。將各樣品的峰面積比代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得腦組織及血樣中的藥物濃度。由各時(shí)間點(diǎn)三個(gè)樣本的平均藥物濃度經(jīng)劑量校正后對(duì)相應(yīng)的時(shí)間作圖，得藥時(shí)曲線，梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積（AUC0t）。以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3. 結(jié)果 NP和LfNP的表征透射電鏡下觀察，制得的NP