最權(quán)威最齊全的pcr匯總及其原理-程序-文庫吧
2025-06-29 14:38 本頁面
【正文】 以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RTPCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。 RT PCR（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RTPCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 反轉(zhuǎn)錄PCR 一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37℃。 2． 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。反轉(zhuǎn)錄PCR 二、合成cDNA引物的選擇 1． 隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長(zhǎng)序列時(shí)，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長(zhǎng)mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。 2． Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的14%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。 3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄PCR 三、操作步驟 1. 總RNA的提取。 2. cDNA第一鏈的合成（Reverse Transcription）：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。 （1），加入總RNA 15μg，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11μl。在管中加10μM Oligo（dT）1218 1μl，輕輕混勻、離心。 （2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列試劑的混合物： 10PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl 10mM dNTPmix 1μl DTT 2μl 輕輕混勻，離心。42℃孵育25min。 （3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。 ?。?）于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。 ?。?）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RN
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