【正文】 因此進(jìn)行PCR時(shí)需要尋找合適的黏合溫度。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。在管中加10μM Oligo（dT）1218 1μl，輕輕混勻、離心。最適作用溫度為42℃。反向PCR最適溫度為42176。RTPCRTPCR RTPCR簡介 　　反轉(zhuǎn)錄 　　合成cDNA引物的選擇 　　用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。反向PCR 反向PCR是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。 　　3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 　　（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 　　2． 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。在RACE(rapidamplification 熒光量化PCR原理熒光定量PCR 應(yīng)用領(lǐng)域 　　TL988型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀應(yīng)用領(lǐng)域臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。遞減PCR開始先設(shè)定一個(gè)比較高的黏合溫度，每個(gè)循環(huán)黏合溫度下降1℃，到一個(gè)較低溫度以后每個(gè)循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結(jié)束。PCR中引物的黏合溫度(annealing temperature)決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強(qiáng)，但過高則不能實(shí)現(xiàn)引物和模板的結(jié)合，而過低會(huì)產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上。 巢式PCR 應(yīng)用 一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。反轉(zhuǎn)錄PCR 四、注意事項(xiàng)　　1． 在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 　?。?），加入總RNA 15μg，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11μl。 　　2． 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。但如果目標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到4550次。 　　AMV反轉(zhuǎn)錄酶 　　有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。對(duì)于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。反向PCR 簡介 PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴(kuò)增。 　　4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H突變