【正文】 因此進行PCR時需要尋找合適的黏合溫度。PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。在管中加10μM Oligo（dT）1218 1μl，輕輕混勻、離心。最適作用溫度為42℃。反向PCR最適溫度為42176。RTPCRTPCR RTPCR簡介 　　反轉(zhuǎn)錄 　　合成cDNA引物的選擇 　　用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。反向PCR 反向PCR是一種新型的基因擴增方法，它能擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。 　　3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。 　?。?）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 　　2． 為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。在RACE(rapidamplification 熒光量化PCR原理熒光定量PCR 應(yīng)用領(lǐng)域 　　TL988型實時熒光定量PCR儀應(yīng)用領(lǐng)域臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。遞減PCR開始先設(shè)定一個比較高的黏合溫度，每個循環(huán)黏合溫度下降1℃，到一個較低溫度以后每個循環(huán)的黏合溫度保持不變直到結(jié)束。PCR中引物的黏合溫度(annealing temperature)決定了黏合的特異性，溫度越高特異性越強，但過高則不能實現(xiàn)引物和模板的結(jié)合，而過低會產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上。 巢式PCR 應(yīng)用 一般應(yīng)用于動物方面。鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。反轉(zhuǎn)錄PCR 四、注意事項　　1． 在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 　　（1），加入總RNA 15μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。 　　2． 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數(shù)到4550次。 　　AMV反轉(zhuǎn)錄酶 　　有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RTPCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細胞mRNA，三種都可。反向PCR 簡介 PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。 　　4．MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H突變