【正文】 片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。 巢式PCR巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。 　　2． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。輕輕混勻，離心。 　?。?）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的14%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復雜性方面均要小。 　　3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。RTPCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。反向PCR 反向PCR是一種新型的基因擴增方法，它能擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。 　　3. 基因特異性引物 與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。 　　合成cDNA引物的選擇 　　用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。RTPCR 過程 　　RTPCR可以用一步法或兩步法的形式進行。RTPCRTPCR RTPCR簡介 　　反轉錄再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。最適溫度為42176。）由于Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。反向PCR再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。最適作用溫度為42℃。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。在管中加10μM Oligo（dT）1218 1μl，輕輕混勻、離心。 　　3．PCR： 　?。?） PCR管，依次加入下列試劑： 　　第一鏈cDNA 2μl 　　上游引物（10pM） 2μl 　　下游引物（10pM） 2μl 　　dNTP(2mM) 4μl 　　10PCR buffer 5μl 　　Taq 酶（2u/μl） 1μl 　　（2） 加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。 　?。?） 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產(chǎn)物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，　　巢式PCR 實驗步驟 第一步：目標的DNA模板藍色的第一對引物結合。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。 缺點進行第二次PCR墳增引起交叉污染的幾率大。PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。多重PCR 簡介 一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段，(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同.多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。因此進行PCR時需要尋找合適的黏合溫度