最權(quán)威最齊全的pcr匯總及其原理-程序(更新版)
【正文】 片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。 巢式PCR巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。 2． 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。輕輕混勻，離心。 （2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的14%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。RTPCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。反向PCR 反向PCR是一種新型的基因擴(kuò)增方法，它能擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。 3. 基因特異性引物 與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。 合成cDNA引物的選擇 用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。RTPCR 過程 RTPCR可以用一步法或兩步法的形式進(jìn)行。RTPCRTPCR RTPCR簡(jiǎn)介 反轉(zhuǎn)錄再以cDNA為模板經(jīng)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。最適溫度為42176。）由于Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也 會(huì)使全長(zhǎng)cDNA合成量大大減少。反向PCR再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。最適作用溫度為42℃。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。在管中加10μM Oligo（dT）1218 1μl，輕輕混勻、離心。 3．PCR： ?。?） PCR管，依次加入下列試劑： 第一鏈cDNA 2μl 上游引物（10pM） 2μl 下游引物（10pM） 2μl dNTP(2mM) 4μl 10PCR buffer 5μl Taq 酶（2u/μl） 1μl ?。?） 加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50μl。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。 ?。?） 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 巢式PCR 實(shí)驗(yàn)步驟 第一步：目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的第一對(duì)引物結(jié)合。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。 缺點(diǎn)進(jìn)行第二次PCR墳增引起交叉污染的幾率大。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。多重PCR 簡(jiǎn)介 一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同.多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。因此進(jìn)行PCR時(shí)需要尋找合適的黏合溫度
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