【正文】 ；另一類是通過減色效應(yīng)，也就是所測物與功能菁染料發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，通過其褪色程度得出結(jié)論。 免疫分析檢測在免疫分析領(lǐng)域花精染料作為抗體或抗原的標(biāo)記物，可提高分析的靈敏度。熒光免疫分析是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性和熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合的一種方法。其基本原理是將特異性的抗體或者抗原記上熒光基團(tuán)使之成為特異性試劑，與相應(yīng)的抗體或者抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用熒光檢測儀器檢測熒光的現(xiàn)象及各種熒光參數(shù)，從而以熒光為信使，活的樣品中的抗原或者抗體的分布、濃度等信息。由于蛋白質(zhì)的分子中含有眾多的反應(yīng)基團(tuán)，如賴氨酸的氨基、胱氨酸、半胱氨酸，蛋氨酸中的婌基，門冬氨酸中的羥基等。所用的七甲川吲哚菁染料探針可以通過活動性反應(yīng)基團(tuán)與抗原抗體相結(jié)合，形成染料蛋白質(zhì)的結(jié)合物。Willians和pertalta吧七甲川花菁染料用于固相免疫檢測方面，可以測定痕量人體免疫球蛋白。Sowell和agnew heard利用水溶性七甲川花菁染料近紅外熒光染料作為人體血清蛋白的非共價(jià)標(biāo)記物和示蹤物，通過毛細(xì)管電泳檢測不同藥物與人體血清蛋白的結(jié)合能力。藥物與人體血清蛋白結(jié)合后會影響到藥物的毒性、活性和人體對它的排泄。，分別對布洛芬、萘普生等多種藥物進(jìn)行分析。其所用的燃料結(jié)構(gòu)乳chart3。 七甲川吲哚菁染料1989年，砷化鎵鋁（GaALAs）二極管激光器問世，它的工作波長在近紅外區(qū)，這事之與之相匹配的近紅外吸收染料成為功能染料的研究特點(diǎn)之一，每年都有大量的專利文獻(xiàn)報(bào)道。近紅外吲哚碳菁染料作為其中的一種，部分已經(jīng)得到實(shí)際應(yīng)用，并不斷有新的種類涌現(xiàn)。近紅外吲哚碳菁染料吸收和發(fā)射光譜區(qū)位于530nm1200nm（近紅外熒光λem600nm）。相對于常規(guī)熒光（λem 600nm）檢測而言，在紅外區(qū)生物樣本基體吸光或者熒光強(qiáng)度很小，因而背景干擾大大降低，并且由于散射光強(qiáng)度與波長的四次方成反比，隨波長的增加，拉曼散射迅速減小，使散射干擾也越來越小。七甲川作為甲川的吲哚碳菁染料的一種，吸收波長更長，背景干擾更小，應(yīng)用前景也就闊。多甲川吲哚菁染料（也稱3H吲哚菁染料）的基本結(jié)構(gòu)如圖12所示。多甲川吲哚菁染料根據(jù)甲川鏈兩端母核是否相同，可以將其分為對稱型和不對稱型菁染料。甲川鏈上的括號內(nèi)為碳碳雙鍵，括號外有一個(gè)碳原子，故該式中的共扼甲川鏈中含有奇數(shù)個(gè)碳原子。根據(jù)共軛甲川鏈上的碳原子數(shù)可以將染料分為一甲川菁染料，三甲川菁染料，五甲川菁染料和七甲川菁染料等。當(dāng)n=1時(shí)，共軛甲川鏈中含三個(gè)碳原子，稱為三甲川菁染料(或一碳菁染料)，常簡寫為“Cy3”，其中“Cy”取自菁染料“Cyanine”的英文詞頭；當(dāng)n=2時(shí)，共軛甲川鏈中含五個(gè)碳原子，稱為五甲川菁染料(或二碳菁染料)，簡寫為“Cy5”；n=3時(shí)，共軛甲川鏈中含七個(gè)碳原子，稱為七甲川菁染料(或三碳菁染料)，簡稱“Cy7”，以此類推。通過改變n、RRRRRR6即可形成各種對稱與不對稱的多甲川吲哚菁染料。圖12 多甲川菁染料的結(jié)構(gòu)通式 七甲川吲哚菁染料的合成進(jìn)展七甲川菁染料的合成與一般菁染料的合成一樣主要包括三個(gè)步驟：一是堿性雜環(huán)中間體即帶有活性甲基的吲哚環(huán)及其衍生物的合成；二是堿性雜環(huán)中間體與成鹽劑(也稱烷基化試劑)反應(yīng)得到雜環(huán)季銨鹽；三是雜環(huán)季銨鹽與縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)得到目標(biāo)染料。合成吲哚環(huán)的方法大多采用傳統(tǒng)的費(fèi)歇爾合成法，用苯肼或?qū)ξ蝗〈诫屡c甲基酮類化合物通過縮合、環(huán)化即得產(chǎn)物。 線性多甲川菁染料的合成進(jìn)展李群[10]等用1,3丙磺酸內(nèi)酯為季銨化試劑，原甲酸三乙酯為縮合劑，在雜環(huán)氮原子上引入了磺酸基，制備了雜環(huán)氮原子上帶磺酸基的吲哚碳菁染料，這些染料與雜環(huán)氮原子上含有烷基的吲哚三甲川菁染料相比，具有較高的熔點(diǎn)，并在水、甲醇、乙醇等極性溶劑中有較大的溶解度，但其缺點(diǎn)在于產(chǎn)品的產(chǎn)率比較低。樓開炎等合成了一種新型的不對稱水溶性吲哚菁染料。在提純方法上進(jìn)行了改進(jìn)，用薄層色譜[GF254涂板,V(正丁醇):V(冰醋酸):V(水)=2:1:5為展開劑]分離提純，取得比較滿意的效果。與以前相比，樓開炎等在合成純化路線上對每一步中間體都作純化，降低了最后產(chǎn)品的分離難度，利用通常的制備薄層色譜就可以進(jìn)行提純，免去了對高效液相色譜設(shè)備的要求，大大降低了成本。，還有著良好的熒光性能，且在水溶液中發(fā)生聚集較少，因而已成為一類重要的商品化熒光標(biāo)記試劑，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、低聚核苷酸等的生物熒光分析。但此類水溶性菁染料的光穩(wěn)定性是一個(gè)問題。王麗秋等[19]將對甲苯甲酸基引入吲哚環(huán)的N原子上，合成了一系列新型的水溶性吲哚菁染料。與已經(jīng)商品化的菁染料相比，新型的水溶性菁染料除具有與其相似的水溶性和光譜性質(zhì)外，由于將結(jié)構(gòu)較大的分子引入了染料分子中，使其具有相對較好的光穩(wěn)定性。由上可以看出：對稱型水溶性吲哚線性多甲川菁染料通常是先對吲哚雜環(huán)進(jìn)行修飾，再由N原子上帶有活性甲基的取代吲哚雜環(huán)季銨鹽與縮合劑反應(yīng)得到。而不對稱型水溶性吲哚線性多甲川菁染料的合成方法通常是先對吲哚環(huán)進(jìn)行修飾，再用縮合劑與等摩爾的吲哚雜環(huán)季銨鹽反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物，將中間產(chǎn)物與另一種雜環(huán)季銨鹽反應(yīng)，得到不對稱型水溶性的線性多甲川吲哚菁染料。通常用磺酸基、羧基等來對吲哚環(huán)進(jìn)行修飾，修飾的位置主要有吲哚環(huán)的5位或吲哚環(huán)上N成鹽的位置。 剛性橋環(huán)多甲川菁染料的合成進(jìn)展 二十世紀(jì)60年代發(fā)展起來的在多甲川鏈上嵌入橋環(huán)的合成方法，使菁染料多甲川鏈逐步建立。文獻(xiàn)中報(bào)道較多的橋鏈染料主要有兩類：一是在染料的甲川鏈上引入雜環(huán)，如呋喃環(huán)、噻吩環(huán)等；另一類是多甲川鏈中引入剛性脂環(huán)，如方酸環(huán)、茚酮環(huán)、克酮酸環(huán)、環(huán)戊(己)環(huán)及多元環(huán)等。由此根據(jù)共軛甲川鏈中是否含有剛性橋環(huán)，吲哚菁染料也可分為吲哚線性多甲川菁染料和吲哚剛性橋環(huán)多甲川菁染料兩類。剛性橋環(huán)多甲川吲哚菁染料根據(jù)引入的剛性橋環(huán)的不同，可以細(xì)分為方酸吲哚菁染料、中位含氯的五(六)元橋環(huán)吲哚菁染料、克酮酸吲哚菁染料等。SongFengling等[22]利用親水性基團(tuán)對吲哚環(huán)進(jìn)行修飾，同時(shí)在甲川鏈上插入環(huán)烴基團(tuán)合成了一系列的水溶性吲哚剛性橋環(huán)多甲川菁染料。他們對四種菁染料進(jìn)行光穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，提高染料的光穩(wěn)定性可以采取以下三種方法：(1)在傳統(tǒng)的直鏈甲川鏈上引入環(huán)己烯；(2)以芐基溴為烴化試劑使吲哚環(huán)中的氮季銨化；(3)在甲川鏈中引入給電子基團(tuán)。吲哚剛性橋環(huán)多甲川菁染料的合成方法與吲哚線性多甲川菁染料的相似，只是用剛性橋環(huán)代替了傳統(tǒng)的線性多甲川縮合劑。從上述文獻(xiàn)可以看出吲哚菁染料引入剛性橋環(huán)后可以提高菁染料的光穩(wěn)定性，為多甲川菁染料的應(yīng)用開辟了更廣闊的天地。 七甲川吲哚菁染料的性能 光譜性能 具有一個(gè)大的π共軛體系是七甲川菁染料分子的第一結(jié)構(gòu)特征，不同的菁染料具有不同的光譜吸收和發(fā)射位置，共軛體系越大，分子的最大吸收波長越長。當(dāng)菁染料被光照以后，分子中的電子能量增加，由基態(tài)躍遷至單線激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子由單線激發(fā)態(tài)回落至基態(tài)時(shí)，會以光的形式釋放能量，因此，該類化合物具有熒光。由此我們可知，七甲川菁染料可通過其共軛骨架中的甲川鏈的長短調(diào)節(jié)染料分子的最大吸收波長，使之覆蓋紫外到可見光區(qū)域，很容易合成得到近紅外七甲川菁染料。一般甲川鏈上每增加一個(gè)雙鍵可使染料分子的最大和不同聚集態(tài)的形成引起的。由于七甲川菁染料的鍵均勻性是隨著鏈的增吸收波長紅移100nm。在甲川鏈上引入橋環(huán)結(jié)構(gòu)后，波長及波形都會有所改變。同一種染料單體，處在不同狀態(tài)下，其吸收峰也會有所不同，這是由于分子間的相互作用長而提高，所以，當(dāng)發(fā)色體的長度增加時(shí)，譜帶寬度會隨著共軛鏈長度的增加而減小。一般來說，多甲川類菁染料有著很強(qiáng)的吸光強(qiáng)度，超出了一般的染料。 光穩(wěn)定性 七甲川菁染料應(yīng)用于光盤存儲技術(shù)領(lǐng)域中具有很多優(yōu)點(diǎn)，但由于其易發(fā)生光氧化反應(yīng)而使降低了染料的穩(wěn)定性。七甲川菁染料的光氧化反應(yīng)有如下特征：(1)在溶液中的光氧化反應(yīng)符合一級反應(yīng)動力學(xué)過程；(2)當(dāng)雜環(huán)母核結(jié)構(gòu)相同時(shí)，甲川鏈越長，光穩(wěn)定性越差；(3)自敏氧化原初過程中，既存在單線態(tài)氧過程，又存在超氧負(fù)離子過程，單線態(tài)氧起主要作用；(4)光氧化反應(yīng)主要發(fā)生在與雜環(huán)母核相連的次甲基碳鏈上，氧化產(chǎn)物為醛、酮和少量的羧酸等。因此，隨著七甲川菁染料中的甲川鏈增長，染料的穩(wěn)定性下降，如：單甲川菁染料和三甲川菁染料在20 ℃下可保存四年之久，七甲川菁染料在常溫下存放幾個(gè)月就會發(fā)生分解。為提高七甲川菁染料的光穩(wěn)定性能,主要可以采用以下三種方法：(1)在甲川鏈上引入不飽和環(huán)體結(jié)構(gòu),增加光氧化反應(yīng)時(shí)的空間位阻,提高其光穩(wěn)定性能；(2)在分子中引入強(qiáng)吸電子基團(tuán), 如NO2,CN等,可降低分子的HOMO軌道的能量,增強(qiáng)其抗氧化性能；(3)將菁染料與單線態(tài)氧淬滅劑配合使用。這種淬滅劑可以是金屬螯合物類、胺類、氮雜環(huán)類、色滿類、酚類和有機(jī)磷化合物等多種材料。由于第一種方法常常引起染料溶解度的下降,第二種方法易引起染料吸收光譜的藍(lán)移,因此第三種方法最為常用, 效果也最明顯。 溶解性 七甲川菁染料具有優(yōu)良的光學(xué)物理特性：較高的摩爾消光系數(shù)、最大吸收波長、可調(diào)諧范圍大等特點(diǎn)，但其溶解性不高，光穩(wěn)定性差等性質(zhì)限制了其應(yīng)用，尤其是在生物熒光檢測方面。在吲哚的苯環(huán)及氮原子上的取代基上引入SO3H、COOH、OH等基團(tuán)能增加染料的水溶性。大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)磺酸基的引入不僅增加了染料的水溶性，而且提高了其穩(wěn)定性，當(dāng)用羰基代替磺酸基時(shí)，水溶性有所下降。雜環(huán)氮原子上所連的基團(tuán)對介質(zhì)的物理性質(zhì)影響較大，一般在氮原子上引入長鏈或支鏈烷基能提高染料在乙醇中的溶解度。吲哚三碳菁染料的雜環(huán)氮原子上連有環(huán)烷烴時(shí)，能改變其在CDR光盤涂層溶劑中的溶解度。華東理工大學(xué)姚祖光等測定了雜環(huán)氮原子上不同烷基取代的系列吲哚五甲川菁染料在乙醇中的溶解度，結(jié)果與上述結(jié)論相同。 七甲川吲哚菁染料的分離類型薄層色譜(Thin layer chromatography, TLC)是一種快速、簡單高效的分離制備法，它將吸附劑均勻鋪在玻璃板上，將欲分離樣品點(diǎn)加到薄層上，然后用合適的溶劑展開而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。TLC兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品(幾到幾微克，)的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，可把吸附層加厚加大，可用來精制樣品。此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。此外，TLC法可用來跟蹤有機(jī)反應(yīng)，進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”。在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，常利用TLC觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。常用的TLC板有軟板和硬板兩種，前者是將吸附劑直接鋪在板上制成，后者是在吸附劑中加入粘合劑或溶劑，調(diào)制后涂布于板上。本文以硅膠為吸附劑，采用硬板操作。吸附柱色譜在玻璃管中填入表面積很大、經(jīng)過活化的粉狀固體吸附劑（固定相）硅膠，從柱頂加入樣品溶液，當(dāng)溶液流經(jīng)吸附柱時(shí)，各組分被吸附在柱的上端，然后從柱上方加入洗脫劑，由于各組分吸附能力的不同，在固定相中反復(fù)發(fā)生吸附解析再吸附再解析的過程，由于各物質(zhì)結(jié)構(gòu)的極性不同，它們隨著洗脫劑向下移動的速度也不同，于是形成了不同的色譜帶。繼續(xù)用溶劑洗脫，已經(jīng)分開的溶質(zhì)可以從柱上分別析出收集。色譜法又稱色層法、層析法，是分離、提純和鑒定化合物的重要方法之一，它是一種物理的分離方法，其基本原理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其親和性能的差異，使混合物的各組分隨著流動的液體或氣體（稱流動相），通過另一種不動的固體或液體（稱固定相），進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用從而使各組分分離。 影響七甲川吲哚菁染料的光穩(wěn)定因素 七甲川吲哚菁染料的氧化機(jī)理在實(shí)際的光化學(xué)應(yīng)用中，染料需要具備高光穩(wěn)定性，而菁染料的最大問題就是染料對光、熱、氧、臭氧的不穩(wěn)定。且染料中的甲川鏈越長，染料越易分解，影響了染料的廣泛應(yīng)用，因而研究和解決普染料的光穩(wěn)定性具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義[11]。菁染料是含鏈共軛結(jié)構(gòu)的分子，它對可見、近紅外光的吸收源自于電子躍遷，因此，凡是能降低躍遷能差的結(jié)構(gòu)都有利于分子吸收波長的紅移，反之，則發(fā)生紫移。Ping Chen等證實(shí)：菁染料的褪色主要是由光氧化引起的， 它有電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移兩種機(jī)制，為一階動力學(xué)關(guān)系[1214]。 （1）能量轉(zhuǎn)移機(jī)制：Dye ＋ hv → Dye ； Dye＋ O2 → Dye ＋ 1O2(1Δg) ； 1O2 ＋ Dye → DyeO2(Fading) （2）電子轉(zhuǎn)移機(jī)制：Dye ＋ hv → Dye； Dye＋ O2 → Dye＋O2 ； O2 ＋ Dye → Fading。能量轉(zhuǎn)移過程是由染料自身的光敏化產(chǎn)生了單線態(tài)氧而破壞染料；而電子轉(zhuǎn)移過程是由染料自身的光敏化產(chǎn)生的超氧負(fù)離子氧化過程所致[5]。所有上述可能的反應(yīng)機(jī)理過程都是由于具有反應(yīng)活性的氧( 單線態(tài)氧和超氧負(fù)離子)所致。因此，凡是能延緩這個(gè)過程的結(jié)構(gòu)變化都將增加菁染料的穩(wěn)定性。 增加菁染料穩(wěn)定性的途徑 增加鏈的長度 鏈長度的增加顯著增加菁染料的最大吸收波長，且與分子軌道理論的計(jì)算結(jié)果相符。Reda Mahmoud Abd E1Aal 給出了一個(gè)粗略計(jì)算躍遷能的公式： △Etheo=h2/8mL2(N＋1) 其中：h為普朗克常量，m 為電子質(zhì)量，L為鏈長度，N 為雙鍵個(gè)數(shù)。從公式中可以看出，隨著鏈的增加，雖然 L與 N 都增加，但L為二階，故△Etheo減小，相應(yīng)的吸收波長增大。因此絕大多數(shù)的五甲川功能菁染料最大吸收波長都小于 700nm，真正能在近紅外領(lǐng)域發(fā)揮作用的很少。然而，隨著多甲川鏈的增加，功能菁染料的穩(wěn)定性迅速下降，主要是由于鏈的增長使鏈更加柔順，易于遭受 1O2 和 O2 的進(jìn)攻。因此，超過七甲川的功能菁染料的報(bào)道幾乎沒有。目前人們使用和研究的近紅外功能菁染料絕大部分是七甲川?？梢姡绊懠t外吸收功能菁染料最大吸收波長和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素是多甲川鏈的長度。 橋環(huán)結(jié)構(gòu) 橋環(huán)結(jié)構(gòu)是公認(rèn)較好的結(jié)構(gòu)改進(jìn)，在改進(jìn)菁染料的穩(wěn)定性方面受到了廣泛關(guān)注。在甲川鏈上引入不飽和環(huán)體結(jié)構(gòu)