【正文】 Marker，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，過硫酸銨， TEMED 器材 恒溫水浴鍋，分光光度計，超凈臺，移液器，臺式離心機，恒溫震蕩搖床，漩渦振蕩器， PCR擴增儀，凝膠電泳系統(tǒng)，Eppendorf 管，紫外燈，冰箱，凝膠成像系統(tǒng)， PH 計，電子天平，低溫離心機。 3 原理 質(zhì)粒的提取 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺產(chǎn)因子，大小從 1200kb不等，為雙鏈閉環(huán)的 DNA 分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。我們用堿裂解的方法來制備質(zhì)粒 DNA. PCR擴增 9 PCR擴增是由變性、退火、和延伸 3 個步驟反復循環(huán)實現(xiàn)的。其中每一步的溫度、時間以及循環(huán)次數(shù)等參數(shù)都是非常重要的。 DNA擴增結(jié)束后進行 DNA凝膠電泳。電泳是帶電物質(zhì)在電場中向著與其相反的電極移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定的 PH值條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。在 DNA 操作中常用的凝膠有兩種：（ 1）瓊脂糖凝膠電泳（ 2）聚丙烯酰胺凝膠 本次試驗擴增的 是擬南芥蛋白激酶 PKS5基因，基因大小為 。 PKS5 編碼 435個氨基酸。 限制性酶切及表達載體的構(gòu)建 限制性內(nèi)切酶是一種能夠識別和切割 DNA雙鏈內(nèi)特殊的核苷酸序列。限制性內(nèi)切酶都有最適的反應溫度和緩沖液的濃度，其中溫度的要求是最嚴格的，一般是 37℃ ，但也有30℃ 條件下比 37℃ 稍好的。限制性內(nèi)切酶的反應需要有 Mg離子做輔助因子，濃度一般是 5mmol/L， PH為 之后進行凝膠電泳，然后回收片段。 表達載體構(gòu)建時要注意在原核細胞中的高效表達載體，這些載體通常具有以下 幾個特點：（ 1）有一個強的原核啟動子及兩側(cè)的調(diào)控序列；（ 2）位于讀碼框上游的 SD 序列與起始密碼子之間有合適的距離；（ 3）在外源基因和啟動子之間有正確的閱讀框架；外源基因下游應加入不依賴 P因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。 10 大腸桿菌轉(zhuǎn)化態(tài)細胞的制備以及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 所謂感受態(tài)，即指受體細胞最容易接受外源基因并實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳決定的，同時也受菌齡，外界環(huán)境因子等影響。 外源基因的誘導表達及 SDSPAGE 外源基因在原核生物中的高效表達除了有適宜的載體外，還必須有適 合的宿主細胞及誘導因子。宿主細胞的選擇隊外援基因的表達是至關(guān)重要的，因為外源基因在細菌中的表達往往不穩(wěn)定，常常被水解。 外源基因的表達常采用化學誘導和溫度誘導兩種方法 4 操作方法 基本流程： 細菌基因組 DNA 制備 ——→ 質(zhì)粒 DNA 的提取 ——→ 對DNA PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳 ——→ 限制性內(nèi)切酶消化DNA 及表達載體的構(gòu)建 ——→ 感受態(tài)細胞的制備、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 ——→ 外源基因的誘導表達、 SDSPAGE 基本步驟 細胞基因組 DNA制備 取 1ml 大腸桿菌， 5000rpm， 2min 離心，棄上清，重復一次。沉淀中加入 TE 緩沖液，充分懸浮。加 10%的 SDS和蛋白酶 k， 37%溫育 10min。加 Nacl，混勻。加 CTAB/Nacl，溫育 10min。加氯仿 /異戊醇，混勻，離心，取上清，加酚 / 11 氯仿 /異戊醇后，取上清。加異戊醇，棄上清。加乙醇，棄上清。沉淀在室溫干燥，溶解于 TE 中保存。 質(zhì)粒 DNA的提取 取培養(yǎng)物離心 2min，棄上清，重復一次分別加溶液 Ⅰ ，溶液 Ⅱ ，溶液 Ⅲ 以及相關(guān)的操作結(jié)束后， 4 ℃ 8000rpm離心后取上清液，然后加入等體積的苯酚：氯仿：異 戊醇（ 25：24： 1），混勻， 12020rpm 離心。取上層后加入等體積的異丙醇離心棄上清，用 70%的乙醇漂洗后干燥，并加入RNaseA， 37℃ 保溫 PCR基因擴增及瓊脂糖凝膠電泳 分別加入 PCR 擴增所需的試劑，稍作離心加入石蠟油，然后設(shè)定好程序進行 PCR,PCR 結(jié)束后加入 200ulTE 緩沖液， 300ul苯酚 /氯仿 /異戊醇 120200rpm離心，取上清加 10%體積的 NaAc 和 倍的冰冷無水乙醇， 20℃ 冰箱中放置30min。 4℃ 12020rpm離心，棄去上清，加 1ml冰冷的 70%乙醇 再離心一次，棄去上清液后干燥， 30ulTE 緩沖液溶解沉淀，然后進行凝膠電泳確認，回收 PCR產(chǎn)物，備用。 限制性內(nèi)切酶消化及表達載體的構(gòu)建 將 PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒分別用 BamHⅠ 和 EcoRⅠ 雙酶切，然后將酶切質(zhì)粒， PCR產(chǎn) 物， 10PCR Buffer和 DNA連接酶加入 PCR管中，然后在 16℃ 條件下保溫過夜，零下 80℃ 保存?zhèn)溆谩? 12 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 取大腸桿菌培養(yǎng)液 2ml 至 Eppendorf 管中，冰浴使其停止生長， 4℃ 離心，棄去上清液。用 沉淀，在離心一次，棄去上清液，再用 冰冷的含 20%甘油的 ，冰浴30min， 4℃ 離心棄上清，沉 淀用 100ul冰冷的含 20%甘油的 +溶解，冰浴，備用。 將重組質(zhì)粒加入感受態(tài)細胞中，冰置 30min 然后 42℃ 水浴 2min，然后分別加入 SOC培養(yǎng)液使其正常生長，將菌液搖勻后涂布到 Amp培養(yǎng)基上。 37℃ 培養(yǎng) 1624h，觀察結(jié)果。 外源基因的誘導表達及 SDSPAGE 將導入重組子的 BL21 菌落接種于 2ml含有 Amp和氯霉素的 LB培養(yǎng)基中，取培養(yǎng)液 100ul于 5ml含 Amp的 LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 23h，然后加入四環(huán)素培養(yǎng)，取 1ml 樣品作為IPTG誘導前的樣品， 20℃ 保存。將誘導前的樣品和誘導后的樣品分別離心，回收沉淀，將沉淀用緩沖液和雙蒸水溶解并在沸水浴中 10min立即放入冰浴中冷卻。 12020rpm 離心2min，回收上清液，然后取 10ul的誘導前的對照樣品與 5ul的誘導后的樣品以及 5ul的 Protein MW Marker上樣，進行SDSPAGE分析。電泳結(jié)束后拍照、分析。 5 結(jié)果 分析 13 中測得 A280 為 ， A260 為 。 A280/A260為 ，說明提取到的 DNA含有雜質(zhì)。雜質(zhì)可能為蛋白質(zhì)或者 RNA。 中測得 A280 為 ， A260 為 。 A280/A260為 ，目前說明比較純凈，要證明是否純凈，還需進一步電泳才能肯定。 電泳條帶如下圖 篇三：基因工程論文 西安工程大學 生物工藝學課程論文 題 目：轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)應用姓 名： 學院 ： 班 級： 學 號：王 超環(huán)境與化學工程學院 10級生物工程 101班41004020209 二〇一一年十一月 轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)應用 王 超 (西安工程大學 ,環(huán)境與化學工程學院 ,10級生物工程 101班 ,郵編 :710600) 摘要：本文主要對動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應用做了具體的分析和概述，使我們能夠更加深層次地認識和理解轉(zhuǎn)基因技術(shù)， 14 并且用舉例的方法詳細的、綜合的介紹了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動物方法以及近些年逐步發(fā)展起來的用來提高轉(zhuǎn)基因效率的技術(shù)，如：非定點整合轉(zhuǎn)基因方法、基因打靶技術(shù)等。綜合了現(xiàn)在人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應用現(xiàn)狀以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的社會情況。 關(guān)鍵字：動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)；基因打靶技術(shù)；生物發(fā)生器；應用；前景展望。 Abstract: This paper mainly in animal transgenic technique application analysis of a concrete and overview, allows us to more deep knowledge and understanding of GM technology, and are used for example detailed, prehensive introduction to the traditional methods of transgenic animals and gradually developed in recent years to improve the efficiency of transgenic technology, such as: nonsitespecific integration of transgenic methods, Gene targeting, and so on. Comprehensive now, its on the application of transgenic technology, and social situation of transgenic technology. Keywords: The animal transfers the gene technology。 Gene target practice technology。 Biological generator。 Using。 Prospect forecast. 1 15 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的核心，是把遺傳的功能單位 ──基因轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)，使它成為動物體內(nèi)的一部分。被轉(zhuǎn)移的基因可以來自同種或異種動物，也可以來自植物或微生物，打破了物種之間的界線。不過目前的雜交是低水平的，只限于主管一兩個性狀的一兩個基因。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，一次可以轉(zhuǎn)移的遺傳信息將越來 越多，那時就可以實現(xiàn)真正意義上的動植物之間的雜交 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的介紹 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指用人工分離和修飾過的外源基因?qū)肷矬w的基因組中，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生改變的