【正文】 素和其它物質(zhì)的溶液中提純水蛭素的方法，其特征在于該方法包括使所述溶液經(jīng)過(guò)金屬離子親合色譜法處理的步驟，其中銅離子（Ｃｕ ++）用作金屬離子，磷酸鹽緩沖劑用作洗脫液。 動(dòng)物血水蛭水解法及其水蛭水解血 動(dòng)物血水蛭水解法及其水蛭水解血，是關(guān)于動(dòng)物血的新的利用方法，使食血水蛭充分吸取動(dòng)物血，數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)后用物理或化學(xué)方法使血液從水蛭體內(nèi)流出，收集 流出的橙紅色血液體。該法獲得的水蛭水解血有含中小分子量蛋白質(zhì)或肽的動(dòng)物血，還含有水蛭素、消化血液的纖維蛋白酶（原）、透明質(zhì)酸酶及其它目前難以測(cè)定 的有用的水蛭分泌物。 $本法能有效降解動(dòng)物血并使之含有醫(yī)用價(jià)值的水蛭素、透明質(zhì)酸酶等水蛭分泌物，水蛭還可多次使用，提高其利用率。 基于水蛭素氨基酸 序列的凝血酶抑制劑 一種凝血酶抑制劑，它包括：大體積疏水性的第一部分，該部分能與負(fù)責(zé)蛋白酶解的凝血酶催化位點(diǎn)作用；和能維持下述氨基酸的疏水性和酸性的第二部分，其中的 氨基酸是指天然水蛭素在Ｃ端非催化區(qū)Ｎ－乙酰 —水蛭素４５ —６５處的氨基酸５５ —６０。在第一部分和第二部分之間是共價(jià)鍵連接部分。該化合物實(shí)用于治療血 栓形成類(lèi)疾病。 水蛭素 本發(fā)明涉及一種中藥制品，它包括，蜂蜜、水蛭，制成水蛭素。 $其優(yōu)點(diǎn)在于，水蛭素可點(diǎn)眼也可結(jié)膜下注射，使用方便，免去手術(shù)的痛苦。水蛭素作用于角膜使混 濁膠原纖維（即角膜實(shí)質(zhì)層）透明 。水蛭素通過(guò)結(jié)膜下注射方法作用于晶體使混濁的晶體蛋白從新溶解透明。玻璃體為透明的質(zhì)酸，各種原因引起混濁水蛭素可使質(zhì) 酸水解。以上疾病一旦發(fā)生，使用水蛭素均能使視力提高從而達(dá)到治療的目的。 新型分泌表達(dá)載體及其在重組水蛭素表達(dá)技術(shù)中的應(yīng)用 一種基于大腸桿菌 ()L－門(mén)冬酰胺酶信號(hào)肽新型簡(jiǎn)并基因的高效分泌表達(dá)載體及其在表達(dá)重組水蛭素中的應(yīng)用，該載體包括 tac強(qiáng)啟動(dòng)子、 L－門(mén) 冬酰胺酶信號(hào)肽新型簡(jiǎn)并基因以及 pUC18 高拷貝復(fù)制原點(diǎn)。將目的基因置于信號(hào)肽基因下游進(jìn)行表達(dá)，目的產(chǎn)物便可形成正確的空間構(gòu)象同時(shí) 分泌至細(xì)胞外周質(zhì) 或 /及培養(yǎng)液中，本發(fā)明對(duì)表達(dá)生物活性蛋白或多肽時(shí)保證分子內(nèi)二硫鍵的正確構(gòu)象、方便表達(dá)產(chǎn)物的下游提取與純化具有重要的意義。 一種新型雙功能水蛭素及其制備方法和應(yīng)用 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兼具抗凝血酶活性和抗血小板聚集活性的雙功能水蛭素 (Bifunctional RebinantHirudin)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和制備方法及其應(yīng)用。根據(jù)對(duì)野生型水蛭素的結(jié)構(gòu)及其生化特性的分析，設(shè)計(jì)了新型雙功能水蛭素分子結(jié) 構(gòu)?；瘜W(xué)合成突變體基因，然后與真核表達(dá)載體 pPIC9K重組，轉(zhuǎn)化甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母 GS115，篩選高表達(dá)工程菌。工程菌經(jīng)發(fā)酵擴(kuò)增，離心收集上清液，經(jīng) 三步法純化雙功能水蛭素。所得產(chǎn)品凍干后，具有抗凝血酶活性并能顯著抑制 ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，對(duì)于預(yù)防血栓性疾病的發(fā)生有明顯的作用。 水蛭素基因 hv2－ 47k 及其合成與表達(dá) 本發(fā)明是以天然水蛭素的二十多種變異體的氨基酸序列資料為依據(jù)，以 HV2型水蛭素為原型，將其第 47位天冬酰胺 (N)替換為賴(lài)氨酸 (K)，選用甲醇酵母 Pichia pastoris 所喜好的遺傳密碼子，合成八段脫氧核苷酸片段 (引物 )，采用遞歸式 PCR(Recursive PCR)法進(jìn)行拼接，最終得到可插入 pPIC9 質(zhì)粒載體的新型水蛭素基因 hv2－ 47k。 hv2－ 47k基因在甲醇酵母 Pichia pastoris 中以分泌型表達(dá)，上罐發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液上清中新型水蛭素表達(dá)量不低于 30,000ATU/ml(誘導(dǎo) 50 小時(shí) )，相當(dāng)于 ，此為可檢索文獻(xiàn)中水蛭素表達(dá)量之首。 來(lái)源于馬尼拉水蛭的透明質(zhì)酸酶 ,分離、純化和重組生產(chǎn)方法 本發(fā)明涉及一種來(lái)源于熱帶水蛭馬尼拉水蛭 (Hirudinariamanillensis)的新型透明質(zhì)酸酶的分離、純化和表征。因此，根據(jù)本發(fā)明，這種 新酶被稱(chēng) 為 “馬尼拉水蛭酶 (manillase)”。本發(fā)明還涉及馬尼拉水蛭酶的重組生產(chǎn)方法，包括 DNA和氨基酸序列以及表達(dá)載體和宿主系統(tǒng)的公開(kāi)。最 后，本發(fā)明涉及馬尼拉水蛭酶用于治療目的的用途，例如，用于治療心肌疾病、血栓事件和腫瘤。 用于由大腸桿菌向培養(yǎng)基中分泌來(lái)制備 Leu－水蛭素的信號(hào)序列 本發(fā)明涉及一種含有一種信號(hào)序列和 Leu－水蛭素序列的水蛭素前體及其制備方法和用途，并涉及一種尋找用于在大腸桿菌中分泌表達(dá)任何目的蛋白的信號(hào)序列的方法和用于在大腸桿菌中分泌表達(dá)任何目的蛋白的方法。 用酵母分泌表達(dá)重組水蛭素 本發(fā) 明公開(kāi)了一種用甲醇營(yíng)養(yǎng)酵母分泌表達(dá)重組水蛭素的新型工藝方法。將合成的水蛭素基因放入酵母的表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化酵母后經(jīng)分泌表達(dá)和一系列純化步驟，可以制備得到高純度、高比活性的重組水蛭素。 重組水蛭素的藥物組合 本發(fā)明提供了一種治療肝素相關(guān)性血小板減少癥的藥物組合，其主要成分包括可接受藥物量的重組水蛭素及其醫(yī)藥上可接受的鹽。對(duì)肝素相關(guān)性血小板減少癥具有治療價(jià)值。本發(fā)明中重組水蛭素主要有 2大優(yōu)點(diǎn)， (1)分子量小，幾乎沒(méi)有抗原性； (2)幾乎沒(méi)有毒性。 一種有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法 本發(fā)明提供了 一種有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株，其內(nèi)含有失活的 KEX1基因，相對(duì)于未失活的 KEX1基因，失活的 KEX1基因的編碼區(qū)及非編 碼區(qū)插入了或缺失了 DNA 片段，更具體地，失活的 KEX1基因的編碼區(qū)缺失了第 289～ 1728 位堿基序列，即其編碼的蛋白酶缺失了第 97～ 576 位氨基 酸，采用該重組畢赤酵母菌株表達(dá)水蛭素的發(fā)酵過(guò)程中，完整水蛭素占總水蛭素的比例達(dá)到 60％～90％，完整水蛭素產(chǎn)量達(dá)到 。還提供了一種制備 上述重組畢赤酵母菌株的方法。本發(fā)明有利于減少水蛭素降解的重組畢赤酵母菌株能有效減少發(fā)酵 過(guò)程中水蛭素的降解，提高水蛭素的產(chǎn)量，并有助于下游的純化， 使得生產(chǎn)成本降低。 一種測(cè)定人血漿和 /或血清中重組雙功能水蛭素的方法 本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法，具體涉及一種測(cè)定人血漿 /血清中重組雙功能水蛭素的分析方法。本方法采用超濾法分離蛋白，解決了水溶 性的水蛭素和蛋白的分離問(wèn)題；采用冷凍干燥技術(shù)，使血樣中微量的水蛭素得以富集；采用質(zhì)譜檢測(cè)器，明顯提高了檢測(cè)的選擇性和靈敏度；整個(gè)色譜分析過(guò)程時(shí)間 為 15min以?xún)?nèi)。本方法樣品取樣少，前處理簡(jiǎn)單、快速、靈敏，分析周期短，可使水蛭素測(cè)定的選 擇性提高，靈敏度提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于重組雙功能水蛭素 體內(nèi)藥物的濃度測(cè)定。本方法還可對(duì)游離重組雙功能水蛭素的濃度進(jìn)行測(cè)定。 一種重組雙功能水蛭素口服制劑及其制備方法 本發(fā)明屬藥劑學(xué)領(lǐng)域，涉及重組雙功能水蛭素特殊口服制劑及其制備方法。本發(fā)明利用超臨界 CO2流 體包衣技術(shù)，以聚乳酸為包衣材料包覆重組雙功能水蛭素藥物顆粒，制成口服制劑，所制備的制劑顆粒規(guī)則，表面光滑，外觀均勻，無(wú)粘連，平均粒徑在 70105μm，載藥量、包封率高。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明具有抗凝作用，口服后 24小時(shí)內(nèi)有效，具有緩釋作用，能克服現(xiàn) 有技術(shù)的缺陷，拓寬了臨床應(yīng)用 范圍，宜用于治療和預(yù)防慢性的血栓性疾病。 一種水蛭的真空冷凍干燥工藝 本發(fā)明涉及一種水蛭的真空冷凍干燥工藝，其將水蛭進(jìn)行預(yù)凍后，進(jìn)行切割，裝盤(pán)。將該盤(pán)放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍，使水蛭內(nèi)的水分凍結(jié)，在高真空狀態(tài)中，進(jìn) 行升華干燥，使得水蛭的含水量降到 10％以下，再對(duì)水蛭加熱，進(jìn)行解析干燥，使其含水量繼續(xù)下降，直至達(dá)到要求。該工藝干燥后的水蛭保持了營(yíng)養(yǎng)成分和活性 物質(zhì)，含水率低。 一種以菲牛蛭唾液為原材料的水蛭素生產(chǎn)工藝 一種以菲牛蛭唾液為原材料的水蛭素生產(chǎn)工藝，屬于中藥制藥領(lǐng)域，涉及動(dòng)物有效成分的提取。目的是解決傳統(tǒng)水蛭素提取工藝難以工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題。該工藝用菲 牛蛭唾液提取水蛭素，可以工業(yè)化生產(chǎn)。菲牛蛭唾液用生理鹽水提取，提取液煮沸、過(guò)濾、取濾液。固形物用生理鹽水提取，過(guò)濾，取濾液。合并前后的全部濾液， 加入 Lyphgel處理兩次，過(guò)濾，去濾液。固