植物細胞工程課件 第三章 細胞克隆與種子細胞篩選-文庫吧
2025-01-05 07:37 本頁面
【正文】 培養(yǎng) 單細胞克隆 原代培養(yǎng) primary culture 取材 培養(yǎng) ? 組織解離 ? 機械分離 取材 ? 解離一般是借助酶和鰲合劑處理組織，使其成為分散的細胞。常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶，鰲合劑主要有 EDTANa和檸檬酸鈉。 ? 一般直接用鑷子、解剖刀解剖組織、器官，然后加以整理用于培養(yǎng)。 動物細胞原代培養(yǎng)過程 ? 不同取材方法，原代細胞培養(yǎng)方式亦不相同 . ? 一般來講，分離獲得的材料多采用 組織塊培養(yǎng) ，而通過解離獲得的細胞材料多采用 單層細胞培養(yǎng) 和 懸浮培養(yǎng) 。 培養(yǎng)方法 組織塊培養(yǎng) 1. 將組織剪切成碎塊 2. 用平衡鹽溶液漂洗 3. 在解剖鏡下切除脂肪 、 壞死組織等 4. 切成 1mm3大小 5. 再漂洗 23次 6. 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng) 。 特點 直接切割分離的組織塊 ， 在一定程度上保持了原有的組織結(jié)構(gòu) ， 對于初期體外培養(yǎng)的環(huán)境適應(yīng)性比直接分離成單細胞要強 ， 因此 ， 短期組織塊培養(yǎng)成為動物細胞培養(yǎng)的材料來源之一 。 1. 將解離獲得的細胞沉淀 2. 用培養(yǎng)液配制成需要的細胞懸液 3. 接種到培養(yǎng)瓶內(nèi) 4. 水平放置 ， 37℃ 下靜止培養(yǎng) 5. 每隔 12天換培養(yǎng)液一次 6. 培養(yǎng)一定時間后 ， 細胞在培養(yǎng)瓶底即形成一單細胞層 。 單層細胞培養(yǎng) 特點 ? 更換培養(yǎng)基容易 ? 便于觀察不同條件對細胞生長的影響 ? 培養(yǎng)后期容易使用灌注技術(shù)改善營養(yǎng)條件 ? 細胞貼附于基底質(zhì)上，更容易表達產(chǎn)物 ? 單層細胞培養(yǎng)可適用于許多動物細胞的原代培養(yǎng)。 適用細胞 具有非貼壁特性的細胞 ， 如血細胞 、 腹水細胞等 ， 或者通過機械攪拌和振蕩能夠較好地維持懸浮狀態(tài)的細胞 。 懸浮細胞培養(yǎng) 在相應(yīng)的培養(yǎng)容器內(nèi)接種一定密度的細胞懸液 。 接種密度與細胞倍增時間有關(guān) ， 倍增時間在 2448h的細胞類型接種密度以 105/ml細胞為宜 ，倍增時間在 1218h的細胞類型接種密度以2 104/ml為宜 。 單個培養(yǎng)瓶的接種體積以厚度不超過 2cm為好 。 基本方法 與植物細胞的懸浮培養(yǎng)相似 繼代培養(yǎng) subculture ?單層細胞培養(yǎng) 貼壁細胞再培養(yǎng) ?懸浮培養(yǎng) 非貼壁細胞培養(yǎng) 從原代培養(yǎng)物中解離細胞： ?震蕩法 在培養(yǎng)瓶中加入平衡鹽溶液 ， 輕輕震動培養(yǎng)瓶 ， 可以使貼壁疏松的細胞進入到溶液內(nèi) ， 然后收集洗滌用于培養(yǎng) 。 ?蛋白酶消化 用 PBS配制 %的胰蛋白酶消化液 ， 37℃ 處理 515min.， 然后洗滌用于培養(yǎng) 。 ?EDTA溶 液 洗 滌 用 PBS配制 1mmoll1d EDTA， 棄去原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液 ， 轉(zhuǎn)入 EDTA洗滌細胞 ， 然后再用 %的胰蛋白酶消化 ， 次法用于貼壁性極強的細胞獲取 。 ?機械剝離 用細胞刮 、 細胞鏟或其它工具直接剝離原代培養(yǎng)物 。 切取擬培養(yǎng)的動物器官或大組織塊 洗去血污 剔除多余成分 切成約 1mm3大小的組織塊 將所有組織剪碎 用于組織
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