【正文】 后用 100%有機溶 劑 ，以 1ml/min流速沖洗 1h以上。（目的是老化色 譜 柱） （6）在平衡前根據(jù)水相 有機相的比例，首先 調(diào) 整水 有機相的比例接近流 動相水相 有機相的比例，以 1ml/min流速沖洗 30左右（目的是相平衡 過 渡）。如果流 動 相中含有 緩 沖 鹽 ，決不可在柱老化后立即用流 動 相平衡，必需先用 90%以上水 進 行 預(yù) 平衡 30min以上，否 則 ，會 導(dǎo) 致 緩 沖 鹽 在 柱內(nèi)析出 結(jié) 晶 ，嚴 重 時會將新柱永久不可逆地 損 壞。 （ 7）然后更換成新制并經(jīng) ，超聲脫氣后的流動 相，按檢測方法平衡至少 1h，待基線穩(wěn)定后，開始進樣檢測。 （ 8）由于是新柱首次使用，在進樣完成后需立即對色譜柱進行凈化和有機溶劑飽和。方法是：用水 有機相（ 90： 10～ 95:5），以 1h以上 → 再用水 有機相（ 90： 10～ 95:5），以 1ml/min流速沖洗 30min以上（或者采用溶劑梯度變化至 100%有機相沖洗 120min以上） → 最后用 100%有機溶劑，以 1ml/min流速沖洗 1h以上。若流動相中有緩沖鹽，建議用100%水沖洗 1h以上后，再重復(fù)上述凈化程序（但個別品牌 C8或 C18色譜柱不耐受純水沖洗者例外）。 在新色譜柱使用幾次，均正常后，運行完畢 凈化處理程序可簡化為： 用水 有機相（ 90： 10～ 95:5），以 1ml/min流速沖洗 1h以上 → 再用 100%有機溶劑，以 1ml/min流速沖洗 30min以上 → 選擇柱說明書中保存條件（ Storage Conditions）規(guī)定的保存溶劑（ Storage Solvent）沖洗 10倍柱體積以上 →封口，保存。 （ 9）凈化完畢，若次日不再使用，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。 （ 10） 備注： 老化用有機溶劑推薦使用色譜級甲醇，不同品牌色譜柱需區(qū)別對待；水需用去離子的超純水。若色譜柱使用后入庫保存，長時間未使用，重新使用時仍需重新飽和。方法是：用水 有機相（ 90： 10～ 95:5），以→ 再用 100%有機溶劑，以 1ml/min流速沖洗30min以上 → 然后調(diào)整水 有機相的比例接近流動相水相 有機相的比例，以 1ml/min流速沖洗 30左右 → 最后用流動相平衡 1h以上，進樣檢測。必需注意流動相 pH值不能超過色譜柱 pH耐受范圍，過酸容易使鍵合相變態(tài)，過堿則易導(dǎo)致硅膠溶解柱床塌陷。 （ 11） 特別提示： 當(dāng)供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進樣后，由于表面活性劑會在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接接，不接檢測器，用水 乙腈（ 90： 10～ 95:5），以 → 再用 100%乙腈，以 → 然后正向連接好色譜柱，用水 乙腈（ 90：10～ 95:5），以 1ml/min流速沖洗 1h以上 → 再用 100%乙腈，以 1ml/min流速沖洗 1h以上，即可恢復(fù)。 （ 12） 警告： 無論何時，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流動相長時間（ 30min以上）走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至導(dǎo)致柱床局部塌陷或中部開裂。使用與保存時，嚴禁用力甩，絕對杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否則，易導(dǎo)致柱床機械性損壞，則再無再生可能。 （ Normal – Phase Chromatography column） 目前，正相色譜分析最常用的是氨基柱與氰基柱。 （ NH2） 氨基柱可以同時用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時需注意，正相反相交替使用時必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動相互溶。新購氨基柱老化處理及使用基本程序如下： 1）若需要在正相條件下使用 ： ① 用正己烷 乙腈（ 99： 1）以 [備注：氨基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑， 乙腈（ 99： 1） ]。 ② 再根據(jù)待分析用正相流動相極性選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速沖洗約 10倍柱體積。 ③ 用正相流動相平衡 1h以上，確保柱壓控制在 6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進樣檢測。如果要使用的流動相中含有緩沖鹽類，在使用流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約 10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。 ④ 分析完畢，用異丙醇，以 → 再用甲醇，以 1ml/min流速沖洗色譜柱約 10倍柱體積 → 再用異丙醇，以。若使用的分析用流動相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動相沖洗約 30倍柱體積，再按上述方法沖洗。 ⑤ 再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以 1ml/min沖洗約 10倍柱體積，保存即可，一般用正己烷 乙腈（ 99： 1）。 ⑥ 重新在正相條件下使用時，重復(fù)上述 ① ～ ⑤ 過程即可，時間可適當(dāng)減少一半左右。 2）若需要在反相條件下使用 ： ① 先用正己烷 乙腈（ 99： 1）以 → 再依次以 ，用等量的氯仿 → 異丙醇 → 甲醇 → 甲醇 水（ 50：50）分別沖洗柱子約 10倍柱體積 → 再以 ，用 氫氧化鈉溶液沖洗柱子約 30倍柱體積（注意： pH值切不可超過 ） → 立即 用水以 → 最后換成反相流動相平衡 1h以上，待基線平穩(wěn)，進樣檢測。 （備注： 若要使用的反相流動相中含有緩沖鹽類，在用反相流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約 10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時，要特別注意控制 pH值范圍及流動相中水的比例， pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。 最理想的 pH范圍在 pH ，決不允許超過 。） ② 反相條件下使用完畢，凈化處理程序同 C18柱 ,但需注意，沖洗溶劑中有機相不能低于 10%；凈化完畢，先用甲醇以 倍柱體積 → 然后用異丙醇以 → 最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑 [一般用正己烷 乙腈（ 99： 1） ]以1ml/min沖洗約 10倍柱體積 → 密封，保存即可。 （ CN） 氰基柱可以同時用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時需注意，正相反相交替使用時必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動相互溶。新購氰基柱老化處理及使用基本程序與氨基柱基本相同，主要程序如下： 1）若需要在正相條件下使用 ： ① 用異丙醇或正己烷以 。（備注：氰基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑， 。） ② 再根據(jù)待分析用正相流動相極性選用極性相近的氯仿、異丙醇或二氯甲烷以相同的流速沖洗約 10倍柱體積。 ③ 用正相流動相平衡 1h以上，確保柱壓控制在 6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進樣檢測。如果要使用的流動相中含有緩沖鹽類，在使用流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約 10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。 ④ 分析完畢，用異丙醇，以 → 再用甲醇，以 1ml/min流速沖洗色譜柱約 10倍柱體積 → 再用異丙醇，以。若使用的分析用流動相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動相沖洗約 30倍柱體積，再按上述方法沖洗。 ⑤ 再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以 ，保存即可，一般用 正己烷或異丙醇 。 ⑥ 重新在正相條件下使用時，重復(fù)上述 ① ～ ⑤ 過程即可，時間可適當(dāng)減少一半左右。 2）若需要在反相條件下使用： 操作和維護與 C18柱基本相同，但需注意，沖洗溶劑中有機相不能低于10%。 ① 新柱先用正己烷或異丙醇以 → 再依次以 ，用等量的水 乙腈（ 95:5） → THF（四氫呋喃） → 水 乙腈（ 5:95）分別沖洗柱子約 10倍柱體積 [最好再繼續(xù)用水 乙腈（ 5:95）以]→ 最后換成反相流動相平衡 1h以上，待基線平穩(wěn)，進樣檢測。 （備注： 若要使用的反相流動相中含有緩沖鹽類，在用反相流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約 10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時，要特別注意控制 pH值范圍及流動相中水的比例， pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。 最理想的 pH范圍在 pH 。） ② 反相條件下使用完畢，凈化處理程序同 C18柱；凈化完畢，先用甲醇以→ 然后用異丙醇以 沖洗柱子約 10倍柱體積 → 最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑（一般用正己烷或異丙醇）以 → 密封，保存即可。 /陽離子交換色譜柱（ negion/cation exchange column） 陰 /陽離子交換柱屬于強離子交換柱，分為玻璃柱與不銹鋼柱，多用不銹鋼柱。陽離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強陽離子基團，含有磺酸鹽功能團，屬于酸性離子柱，特別設(shè)計用于常規(guī) HPLC分析有機和無機陽離子。陰離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強陰離子基團，含有季胺堿功能團，屬于堿性離子柱，特別設(shè)計用于常規(guī) HPLC分析有機和無機陰離子。對于新柱而言，二者老化、使用與保養(yǎng)程序類似，主要方法如下： （ 1）首先在開始使用系統(tǒng)以前檢查柱子有否微生物生長，否則柱子會堵塞，柱壓會升高到無法接受的水平。然后，不接檢測器，正向安裝色譜柱，使用純甲醇以 。 （ 2）再連接檢測器，用純甲醇以 。 （ 3）然后使用去離子水以 。 （4）最好再確保 連 接好保 護 柱（多使用相 應(yīng) 柱制造商 針對 性提供 的保 護 柱），再用 選 用的洗脫液以 ， 進樣檢測 。同 樣 ，若洗脫液中含有 緩 沖 鹽類 ，在用分析洗脫液平衡之前，先用不含 緩 沖 鹽 的同比例洗脫液 過 渡，沖洗 約 10倍柱體 積 ，避免 緩 沖 鹽 在分析柱內(nèi)析出。 （5）特 別 提示： ① 洗脫液要求是新制的低 電導(dǎo) 率 緩 沖液，或者是有 UV吸收的 緩 沖液。 對 于陽離子交 換 柱，多用 檸 檬酸或酒石酸 緩 沖液（或其混合溶液）、 鄰 苯二甲酸 緩 沖液 ，pH范 圍 從 ；對 于陰離子交 換 柱，多用磷酸 緩 沖液、硝酸 銨 溶液（1mMol/L），鄰 苯二甲酸 緩 沖液， pH范 圍 從 。絕對 禁止使用水 楊 酸 緩沖液，因水 楊 酸分解 產(chǎn) 物會改 變 固定相的性 質(zhì) 。洗脫液在使用以前必 須 用 濾 膜 過濾 并 徹 底脫氣，以防止 發(fā) 生 檢測 和 泵 送 問題 。 ② 提倡在室溫 環(huán) 境使用， 為 了提高分析的 穩(wěn) 定性，可以 設(shè) 置高于室溫 5～ 10℃ 的柱溫，最好不要在 40℃ 以上使用。 2022/2/16 梅特勒上海公司維修部 26 ③ 使用過程中不要超過其耐受最高壓力（不銹鋼柱： 4500psi； 玻璃柱： 3000psi）。 ④ 增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止柱床的擾