【正文】 20倍柱體積進(jìn)行 初始平衡 。其檢測(cè)靈敏度可比使用反相色譜柱提高 10～ 1000倍。 HILIC HPLC Column親水性色譜柱適合于分離在反相色譜柱上不保留的極性化合物，尤其是對(duì)強(qiáng)極性堿性化合物的保留能力強(qiáng)，因此，其成為研究藥物代謝、藥物發(fā)現(xiàn)和組合化學(xué)科學(xué)的首選，尤其適用于 LCMS及 LCELSD。可用于正相、反相和親水液相色譜，是代替氨基柱和硅膠柱的最佳選擇。 + （ Hydrophilic chromatographic column，HILIC） 親水性色譜是正相色譜的一個(gè)變種。柱 壓 （扣除系 統(tǒng) 背景 壓 力）有特殊要求，一般， 150mm柱不得高于 20MPa（3000Psi）；250mm柱不得高于 25MPa（3700Psi）。分析完 畢 ，亦用 純 水以 60min→ 再用乙 腈 沖洗 約 30倍柱體 積 ，密封保存即可。 ③ 也有部分品牌手性柱（ CHIRAL NEV手性柱）用 純 乙 腈 保存，通常在反相條件下使用。即先用水 有機(jī)相（ 95:5或100:0），小 間 隔升高流速至 1ml/min，沖洗 約 30倍柱體 積 → 再用流 動(dòng) 相平衡 1h左右， 進(jìn)樣檢測(cè) 即可。分析完 畢 ，凈 化保養(yǎng)程序同上（ 1）～（ 6）。 （9）特 別說 明： ① 部分手性柱（以 AGP柱 為 例）使用前要求用 10mMol/L的醋酸 銨緩 沖液（Ammonium acetrate Buffer，冰醋酸 調(diào) pH至 ）異丙醇（ 2PrOH）（95:5）進(jìn) 行 預(yù) 平衡。 ③ 由于上述 電 荷遷移添加 劑 與手性柱柱床有很好的 親 和力， 難 以從柱上洗除， 長(zhǎng) 期使用可能會(huì) 導(dǎo) 致柱性能下降。 + ② 辛酸（ OA）及 N，N二甲胺（ DMOA）與水的互溶性有限，在常溫下， 僅僅2mMol/L（OA）或 5mMol/L（DMOA）能均一的溶解于水中，若超此限度，將分 層 。 （8）特 別 建 議 ： ① 當(dāng)分離分析酸堿性手性化合物 時(shí) ，有必要在流 動(dòng) 相加入少量 電 荷遷移添加 劑 （濃 度不超 過 10mMol/L）來提高手性柱的手性 選擇 性。 ⑤ 色 譜 柱保存 時(shí) ，必需保 證 柱內(nèi)無 緩 沖 鹽 或其他 鹽類 物 質(zhì) 殘存。否則，極易導(dǎo)致手性分離不佳、色譜峰嚴(yán)重變寬、色譜峰拖尾及分叉等。 ② 提倡在室溫下使用，但一般要求柱溫不超過 25℃ 。流速一般不大于 ，具體應(yīng)以不超過色譜柱使用壓力上限為準(zhǔn)。 （ 6）分析完畢，用純水以 ，以徹底洗出緩沖鹽，然后用 15%以內(nèi)的異丙醇溶液以 ，密封，保存于 10℃ 左右環(huán)境中，登記備案。 （ 4）再用純水以 。（注意：流速需小間 隔從 0升至 ） （ 2）連接檢測(cè)器，再用純水以 。如果在進(jìn)樣檢測(cè)，進(jìn)樣間隔的洗針液必須更 換成合適的溶劑，最好是 15%～ 20%的異丙醇溶液。一般（以 AGP柱 為例）主要程序如下： （ 1）將色譜柱接到色譜儀器之前，必須先用合適的溶劑沖洗流路（包括六 通閥和定量環(huán)）。 2022/2/16 29 避免過度超載 由于手性柱一般都較為昂貴，使用不當(dāng)又極易導(dǎo)致?lián)p壞，且再生 尤其困難，所以使用、維護(hù)與保養(yǎng)均需特別慎重 。 常用的是蛋白質(zhì)（ Protein）型，其分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用，大多可用于反相色譜條件。通過引入手性環(huán)境使對(duì)映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體分離的目的。其他具體要求，請(qǐng)仔細(xì)閱讀相關(guān)說明書，并以說明書為準(zhǔn)。分析完畢，先用去離子水，以 速?zèng)_洗色譜柱約 30倍柱體積 → 再用 硫酸溶液（陽(yáng)離子交換柱）或氨水溶液（陰離子交換柱）沖洗色譜柱約 10倍柱體積 → 密封，保存即可。 ③ 為防止色譜柱長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)長(zhǎng)菌，應(yīng)使用 （陽(yáng)離子交換柱）或氨水溶液（陰離子交換柱）飽和后保存于 4℃ 左右冰箱中。 [ Rezex ROAOrganic Acid H+(酸性陽(yáng)離子柱 )] ① 柱壓必須控制在 600 psi 之內(nèi)；流動(dòng)相中有機(jī)相比例不得超過 10%，流速應(yīng)小間隔上升至 ，且不得超過 ，降低流速亦然；柱子用超純水飽和后保存于 4℃ 左右冰箱中；運(yùn)行時(shí)，柱溫不超過85℃ 。 2022/2/16 梅特勒上海公司維修部 27 （ 8）使用并正確處理完畢，入庫(kù)保存于防塵環(huán)境下，登記備案。（注意：一定要確保在柱子內(nèi)沒有緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下保存色譜柱。 ⑤ 必須防止將來自流動(dòng)相或者樣品中的疏水性或與流動(dòng)相極性差別很大的化合物進(jìn)入色譜柱，特別地，要絕對(duì)禁止導(dǎo)入顆粒雜質(zhì)，以防止操作壓力增高，污染物難以或者不能去除。 ④ 增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止柱床的擾動(dòng)。 ② 提倡在室溫 環(huán) 境使用， 為 了提高分析的 穩(wěn) 定性，可以 設(shè) 置高于室溫 5～ 10℃ 的柱溫，最好不要在 40℃ 以上使用。絕對(duì) 禁止使用水 楊 酸 緩沖液，因水 楊 酸分解 產(chǎn) 物會(huì)改 變 固定相的性 質(zhì) 。 （5）特 別 提示： ① 洗脫液要求是新制的低 電導(dǎo) 率 緩 沖液，或者是有 UV吸收的 緩 沖液。 （4）最好再確保 連 接好保 護(hù) 柱（多使用相 應(yīng) 柱制造商 針對(duì) 性提供 的保 護(hù) 柱），再用 選 用的洗脫液以 ， 進(jìn)樣檢測(cè) 。 （ 2）再連接檢測(cè)器，用純甲醇以 。對(duì)于新柱而言，二者老化、使用與保養(yǎng)程序類似，主要方法如下： （ 1）首先在開始使用系統(tǒng)以前檢查柱子有否微生物生長(zhǎng)，否則柱子會(huì)堵塞，柱壓會(huì)升高到無法接受的水平。陽(yáng)離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強(qiáng)陽(yáng)離子基團(tuán)，含有磺酸鹽功能團(tuán)，屬于酸性離子柱，特別設(shè)計(jì)用于常規(guī) HPLC分析有機(jī)和無機(jī)陽(yáng)離子。） ② 反相條件下使用完畢，凈化處理程序同 C18柱；凈化完畢，先用甲醇以→ 然后用異丙醇以 沖洗柱子約 10倍柱體積 → 最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑（一般用正己烷或異丙醇）以 → 密封，保存即可。在反相條件下使用時(shí)，要特別注意控制 pH值范圍及流動(dòng)相中水的比例， pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動(dòng)相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。 ① 新柱先用正己烷或異丙醇以 → 再依次以 ，用等量的水 乙腈（ 95:5） → THF（四氫呋喃） → 水 乙腈（ 5:95）分別沖洗柱子約 10倍柱體積 [最好再繼續(xù)用水 乙腈（ 5:95）以]→ 最后換成反相流動(dòng)相平衡 1h以上，待基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測(cè)。 ⑥ 重新在正相條件下使用時(shí)，重復(fù)上述 ① ～ ⑤ 過程即可，時(shí)間可適當(dāng)減少一半左右。若使用的分析用流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相沖洗約 30倍柱體積，再按上述方法沖洗。如果要使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽類，在使用流動(dòng)相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過渡，沖洗約 10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。 ③ 用正相流動(dòng)相平衡 1h以上，確保柱壓控制在 6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。（備注：氰基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑， 。使用時(shí)需注意，正相反相交替使用時(shí)必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動(dòng)相互溶。） ② 反相條件下使用完畢，凈化處理程序同 C18柱 ,但需注意，沖洗溶劑中有機(jī)相不能低于 10%；凈化完畢，先用甲醇以 倍柱體積 → 然后用異丙醇以 → 最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑 [一般用正己烷 乙腈（ 99： 1） ]以1ml/min沖洗約 10倍柱體積 → 密封，保存即可。在反相條件下使用時(shí)，要特別注意控制 pH值范圍及流動(dòng)相中水的比例， pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動(dòng)相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。 2）若需要在反相條件下使用 ： ① 先用正己烷 乙腈（ 99： 1）以 → 再依次以 ，用等量的氯仿 → 異丙醇 → 甲醇 → 甲醇 水（ 50：50）分別沖洗柱子約 10倍柱體積 → 再以 ，用 氫氧化鈉溶液沖洗柱子約 30倍柱體積（注意： pH值切不可超過 ） → 立即 用水以 → 最后換成反相流動(dòng)相平衡 1h以上，待基線平穩(wěn)，進(jìn)樣檢測(cè)。 ⑤ 再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以 1ml/min沖洗約 10倍柱體積，保存即可，一般用正己烷 乙腈（ 99： 1）。 ④ 分析完畢，用異丙醇，以 → 再用甲醇，以 1ml/min流速?zèng)_洗色譜柱約 10倍柱體積 → 再用異丙醇，以。待基線平穩(wěn)后，進(jìn)樣檢測(cè)。 ② 再根據(jù)待分析用正相流動(dòng)相極性選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速?zèng)_洗約 10倍柱體積。使用時(shí)需注意，正相反相交替使用時(shí)必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動(dòng)相互溶。 （ Normal – Phase Chromatography column） 目前，正相色譜分析最常用的是氨基柱與氰基柱。 （ 12） 警告： 無論何時(shí)，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進(jìn)樣檢測(cè)和柱沖洗過程中不能讓流動(dòng)相長(zhǎng)時(shí)間（ 30min以上）走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至導(dǎo)致柱床局部塌陷或中部開裂。 （ 11） 特別提示： 當(dāng)供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進(jìn)樣后，由于表面活性劑會(huì)在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。方法是：用水 有機(jī)相（ 90： 10～ 95:5），以→ 再用 100%有機(jī)溶劑，以 1ml/min流速?zèng)_洗30min以上 → 然后調(diào)整水 有機(jī)相的比例接近流動(dòng)相水相 有機(jī)相的比例，以 1ml/min流速?zèng)_洗 30左右 → 最后用流動(dòng)相平衡 1h以上，進(jìn)樣檢測(cè)。 （ 10） 備注： 老化用有機(jī)溶劑推薦使用色譜級(jí)甲醇，不同品牌色譜柱需區(qū)別對(duì)待；水需用去離子的超純水。 在新色譜柱使用幾次，均正常后，運(yùn)行完畢 凈化處理程序可簡(jiǎn)化為： 用水 有機(jī)相（ 90： 10～ 95:5），以 1ml/min流速?zèng)_洗 1h以上 → 再用 100%有機(jī)溶劑，以 1ml/min流速?zèng)_洗 30min以上 → 選擇柱說明書中保存條件（ Storage Conditions）規(guī)定的保存溶劑（ Storage Solvent）沖洗 10倍柱體積以上 →封口，保存。方法是：用水 有機(jī)相（ 90： 10～ 95:5），以 1h以上 → 再用水 有機(jī)相（ 90： 10～ 95:5），以 1ml/min流速?zèng)_洗 30min以上（或者采用溶劑梯度變化至 100%有機(jī)相沖洗 120min以上） → 最后用 100%有機(jī)溶劑，以 1ml/min流速?zèng)_洗 1h以上。 （ 7）然后更換成新制并經(jīng) ，超聲脫氣后的流動(dòng) 相，按檢測(cè)方法平衡至少 1h，待基線穩(wěn)定后，開始進(jìn)樣檢測(cè)。（目的是老化色 譜 柱） （6）在平衡前根據(jù)水相 有機(jī)相的比例，首先 調(diào) 整水 有機(jī)相的比例接近流 動(dòng)相水相 有機(jī)相的比例，以 1ml/min流速?zèng)_洗 30左右（目的是相平衡 過 渡）。（目的是沖洗出柱出口端無機(jī)雜物與篩板孔雜物，使篩板正常） （4）連 接 檢測(cè) 器，開啟柱溫