【正文】 選擇 ? 常用（ NH4） 2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)： ? a. 溶解度大 ? b. 分離效果好 ? c. 不易引起變性 ? d. 價格便宜 ?2. 鹽析用鹽 2) 鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示 : 溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度＝ 溶液的總體積 3) 調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液） 適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時。 配制飽和硫酸銨溶液 所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算： S2S1 V=V0———— 1S2 式中 V,V0—— 分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積 S2,S1—— 分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度 b. 添加固體硫酸銨 適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時。 按下式計算，得表中數(shù)據(jù) B(S2S1) W= —————— 1AS2 A,B—— 常數(shù)，與溫度有關(guān)。 實(shí)際使用時，可直接查表 （各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表 鹽析操作 ? 低飽和度： 飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過 40％。 ? 高飽和度： 固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。 ? 1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。 ? 2）冰箱中（ 4℃ ）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。 ? 3）沉淀再溶解后可用超濾 （ ultrafiltration） 、透析 （ dialysis） 或?qū)游?（ chromatography） 方法脫鹽。 3. 鹽析曲線的制作 ? 如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 蛋白質(zhì)量 (mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨 飽和度％ 硫酸銨濃度（ %） 枯草桿菌 ?淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 ?4. 鹽析的影響因素 ?1) 離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系： IKSS s ??? 0l o gl o gI：離子強(qiáng)度， I = ∑MZ 2； M：離子濃度（ mol/L）； Z：離子價數(shù) S：離子強(qiáng)度為 I時的蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） S0：離子強(qiáng)度為 0時蛋白質(zhì)的溶解度（ g/L） Ks：鹽析常數(shù)，是與 蛋白質(zhì) 和 鹽種類 有關(guān)的特性常數(shù)。 Ks代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度， Ks越大鹽析效果越好。 當(dāng)溫度一定時 ， S0對于某一溶質(zhì)是常數(shù) ，用 β 表示 ， 鹽析方程式可改寫為： log S = β Ks I 兩種鹽析法： Ks分級鹽析法 ： 在一定的 pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì) Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變 I值）的沉淀方法。 β 分級鹽析法 ： 在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱?pH及溫度的沉淀方法 。 ?2) 蛋白質(zhì)濃度： ? 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，%3%最好。 ?3) pH值： 等電點(diǎn)處最易沉淀。 ?4) 溫度的影響： ?稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。 ?濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。 ? 一般可在室溫下進(jìn)行。某些對溫度敏感的酶，可在 0℃ ～ 4℃ 下操作 。 （二） 有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)） ? 利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。 ? 1. 沉淀機(jī)理 ? 降低溶液的介電常數(shù) ? 部分地引起蛋白質(zhì)脫水 ? 2. 常用有機(jī)溶劑 ? 丙酮 ?乙醇 ?甲醇，用量一般為酶液體積的 2倍左右，終濃度為 70%。 ?： ? 優(yōu)點(diǎn) ： 1） 分辨率比鹽析法高 ? 2） 沉淀不需脫鹽 ? 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心 ? 缺點(diǎn)： 1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活 ? 2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 ? ?4. 影響有機(jī)溶劑沉淀的因素 （ 1）溫度 ： 低溫（ 0℃ ）操作。 （ 2） pH 值： 盡可能靠近其等電點(diǎn)。 （ 3）離子強(qiáng)度： 采用 增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度 目的 防止蛋白質(zhì)變性 （ 4）蛋白質(zhì)濃度： 適當(dāng)，一般為 5? 20mg/ml （三） 等電點(diǎn)沉淀 (isoelectric precipitation) ? ? 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低 ? 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn) ? 2. 使用方法 ? 單獨(dú) 使用 較少 （ 用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白 ） ， 多與其它方法聯(lián)合使用（ 如鹽析法 、 有機(jī)溶劑法 ） ， 因 蛋白質(zhì) 在等電點(diǎn)時仍有一定的溶解度 。 ?3. 優(yōu)點(diǎn)： ? 1） 大多數(shù)蛋白質(zhì)的 pI都在偏酸性范圍內(nèi) ? 2）無機(jī)酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低 ? 3）無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化 ?4. 缺點(diǎn)： ? 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活 ? （四）有機(jī)聚合物沉淀法 1. 作用機(jī)理： 與有機(jī)溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。 2. 沉淀劑： 常用 聚乙二醇 （ Polyethyene glycol，簡寫 PEG ） 多用分子量為 6000～ 20220的 PEG。 3. 優(yōu)點(diǎn)： ?① 操作條件溫和 ， 不易引起生物大分子變性 。 ?② 沉淀效能高 ， 使用少量的 PEG即可沉淀相當(dāng) ? 多的生物大分子 。 ?③ 沉淀后有機(jī)聚合物容易去除 。 ?（五）選擇性變性沉淀法 ? 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 ? ⑴ 熱變性 ? 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固， 加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。 ? ⑵ pH變性 ? 等電點(diǎn)沉淀法是 pH變性法中的一種變體。 ? ⑶ 有機(jī)溶劑變性 ? 使那些對有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。 六、萃?。?extraction）分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。 ?特點(diǎn)： ?1）比化學(xué)沉淀法分離程度高 ?2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快 ?3）比蒸餾法能耗低 （一）溶劑萃取法 明確幾個概念： 料液： 供提取的溶液。 溶質(zhì)： 料液中欲提取的物質(zhì) 。 萃取劑 ： 用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機(jī)溶劑 。 萃取液 ： 經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液 。 萃余液： 被萃取出溶質(zhì)后的料液 。 反萃?。?back extraction）： 完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 ?溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。 ? 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑里，達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。 ? 萃取相濃度 C1 ?分配系數(shù) K0 = —————— = —— ? 萃余相濃度 C2 ? K0值隨溶液 pH的變化甚大，這是用萃取法實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。 ? 普通有機(jī)溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離， ? 因?yàn)?: ?1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機(jī)溶劑 ?2） 蛋白質(zhì)在有機(jī)相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取 。 萃取操作的 3個步驟： 1）混合 2）分離 3）溶劑回收 ?單級萃取 ? 使用一個混合器和一個分離器 ? 單級萃取流程 93 （二） 雙水相萃取技術(shù) ? 又稱水溶液兩相分配技術(shù) ? （ partion of two aqueous phase system） ? 用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（ PEG）和葡聚糖（ Dextran）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá) 70%?90%），故稱 “ 雙水相 ” 系統(tǒng)。 ?優(yōu)點(diǎn)： ?1） 每一水相中均有很高的含水量，為 ?酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境； ?2） PEG、 Dextran和無機(jī)鹽對酶等無毒 ?害作用，不會引起變性。 ： 兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)到一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。 a 雙節(jié)線 系線 b 雙節(jié)線 均相區(qū) 均相區(qū) 兩相區(qū) 兩相區(qū) 系線 臨界點(diǎn) PEG/Dx和 PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖 ? 幾種典型的雙水相系統(tǒng) ? 聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇 ? 葡聚糖（ Dex） ? 羥丙基葡聚糖 ? 聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（ Dex） ? 硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇 ? 羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素 ? 聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、 硫酸銨 ? 硫酸鈉、硫酸鎂 2. 萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。 ?3. 應(yīng)用 ? 胞內(nèi)酶的提取和精制 : ? 除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。 ? ? 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例 酶 菌 種 相系統(tǒng) ? 延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽 ? 天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽 ??半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽 ? 亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dex ? 乙醇脫氫酶 Baker’ s yeast PEG/ 鹽 ? 青霉素?；? E. coli PEG/ 鹽 雙水相萃取法的重要研究方向 —— 親和萃?。ㄓH和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（ ligand）來提高分離選擇性。 親和萃取酶實(shí)例 蛋白質(zhì) 配基 胰蛋白酶 胰蛋白酶抑制劑 磷酸果糖激酶 三嗪染料 甲酸脫氫酶 三嗪染料 葡糖 6磷酸脫氫酶 三嗪染料 ?（三） 超臨界流體萃