【正文】 representational difference analysis, RDA)： RDA充分發(fā)揮了 PCR以 指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈 DNA模板而以 線性形式擴(kuò)增單鏈 模板的特性，通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換 cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增目的基因片段。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 18 因試驗(yàn)對(duì)象 (Tester)和供試探針 (Driver)在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè) 4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度 256bp的代表群(representation)，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。每次 T減 D反應(yīng)中兩者物質(zhì)的量比要求達(dá)到 1:100或更高，經(jīng) 23次重復(fù)， T群體非特異性序列幾乎沒(méi)有偶然逃脫的可能性。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 19 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 20 使用 Gateway?技術(shù)進(jìn)行克隆和表達(dá)一切皆有可能 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 21 通過(guò) TOPO反應(yīng) 將目的基因 PCR產(chǎn)物連接到 Entry載體中。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 22 LR反應(yīng) 可將目的片段從Entry載體 重組 到表達(dá)載體中。 Entry載體上基因兩端具有 attL1和 attL2位點(diǎn)，目的載體中含有attR1和 attR2位點(diǎn)，通過(guò)重組形成新的位點(diǎn) attB1和 attB2，從而將目的基因亞克隆到表達(dá)載體中。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 23 雙向電泳 等電聚焦：蛋白質(zhì)在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的 線性 pH梯度 中電泳。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的 pH條件下帶有電荷，因此可以在電場(chǎng)中移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其 等電點(diǎn) 位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。 SDS聚丙烯酰胺：分子質(zhì)量 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 24 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 25 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 26 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 27 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 28 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 29 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 30 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 31 生物學(xué)問(wèn)題的提出 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點(diǎn)的切取 胰酶對(duì)脫色后蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測(cè)序分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對(duì) 新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證（ western blot等） 蛋白信息的初步獲得 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 32 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù) 基質(zhì)輔助激光解析電離：飛行質(zhì)譜儀 (MALDITOF)。 電噴霧質(zhì)譜 ESIMS： ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 33 從 2D膠中分離得到的或其它來(lái)源的 蛋白質(zhì) ，酶解成 小肽 后與基質(zhì)混合，將樣品混合物點(diǎn)到 金屬靶 表面上并使之干燥 結(jié)晶 ，然后用 激光轟擊 ，將呈 離子化氣體 的待分析物從靶表面噴射出去。 離子化的氣體中每個(gè)分子帶有一個(gè)或更多的正 電荷 ，這些氣體肽段在 電場(chǎng) 中被 加速 后， 到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間由肽段的質(zhì)量和其所帶電荷數(shù)的比值 (m/z)決定。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 34 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 35 生物質(zhì)譜的一般流程： 蛋白酶解成肽段。 肽段分離。 離子進(jìn)入質(zhì)譜，得到質(zhì)譜圖。 用計(jì)算機(jī)軟件將質(zhì)譜圖與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定出蛋白。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●