抗癌的吲哚酚類通過抑制硫氧還原蛋白酶和活化信號的氧化還原來誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞的凋亡論-文庫吧
2024-12-24 08:23 本頁面
【正文】 Cruz Biotechnology (Santa Cruz,獲得 6） 抗硫氧還蛋白 1，磷酸化 p38（ Thr180/ Tyr182）和磷酸化 JNK（ Thr183/ Try185）從）Cell Signaling Technology (Danvers, MA)獲得 7） 細(xì)胞色素 c的抗體是從 BD Pharmingen (San Diego, CA)購買 8） P38抑制劑 4（ 4 氟苯基） 2 （ 4 甲基亞磺酰苯基） 5 （ 4 吡啶基） 1H咪唑 （ SB203580）和 JNK抑制肽 LJNKi購自 Enzo Life Sciences, Inc. (Plymouth Meeting, PA)，PA）。 9） 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 pCMVSPORT6ASK1從 Open Biosystems (Huntsville, AL)購買（亨茨維爾）。 10） 膜聯(lián)蛋白 V染色試劑盒和 EnzChek熒光 Caspase3活性試劑盒購自 Invitrogen公司（卡爾斯巴德獲得， CA）中。 11） 除非指明，所有其它化學(xué)品購自 SigmaAldrich公司 細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染。 1） MIA PACA2人胰腺癌癌細(xì)胞從 American Type Culture Collection (Manassas, VA)獲得。 2） 細(xì)胞培養(yǎng)于 Dulbecco改良的 的 Eagle培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)至含有 4mM的 L谷氨酰胺， 10％（體積 /體積）胎牛血清， ％（體積 /體積）馬血清， 100單位 / ml青霉素，和 100微克 /毫升鏈霉素。細(xì)胞保持在濕潤的培養(yǎng)箱中含有 5％二氧化碳， 37℃。 3） 對于瞬時轉(zhuǎn)染 研究， MIA PACA2細(xì)胞通過電穿孔轉(zhuǎn)染 含有 ASK1基因的人類巨細(xì)胞病毒驅(qū)動載體 pCMVSPORT6或單獨的載體。 4） 然后將細(xì)胞在完全生長培養(yǎng)基中溫育 16小時，之后再用 IQs處理 生長抑制試驗 1）使用生長抑制測定的 MTT比色分析法（參見 Mosmann， 1983） 2）在這些研究中，將對數(shù)期的細(xì)胞以每孔 2 10^3個細(xì)胞接種到 96孔板，一式三份，并且使得貼壁 16h。 3）然后用含有 IQs的完全培養(yǎng)基（ 200微升 /孔）處理 72小時或治療為 4小時無藥物的培養(yǎng)基孵化后，接著培養(yǎng)在藥物培養(yǎng)基， 37℃額外 72小時。 4）去除培養(yǎng)基， 50 微克 MTT添加到 50微 升的完全培養(yǎng)基后，添加到每一孔中，再孵化 4小時。 5）細(xì)胞存活率通過測量來確定 MTT還原成結(jié)晶甲臜的產(chǎn)物，加入 100微升 DMSO講產(chǎn)物溶解。 6）光密度在使用 Thermomax酶標(biāo)儀 550nm波長測定 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). 7） IC 50值被定義為 IQ 的濃度 —— 與對照組相比，導(dǎo)致降低了 50％的細(xì)胞數(shù)的濃度。 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測 1） 細(xì)胞（ 4 10^5）分別接種到 60毫米的培養(yǎng)皿。藥物處理后，將細(xì)胞收集，用 PBS洗滌，重懸在膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液和膜聯(lián)蛋白 V異 硫氰酸熒光素和 PI中，根據(jù)廠商的說明。(Biosource Annexin V detection kit。 Invitrogen) 2） 膜聯(lián)蛋白 V和 PI染色使用 FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析 (BD Biosciences, San Jose, CA)。細(xì)胞被陽性膜聯(lián)蛋白 V染色的計為凋亡細(xì)胞。 caspase3活性測定 1)caspase3的活性測定使用 EnzChek caspase3的測定按照試劑盒（ Invitrogen公司 )制造商的說明。簡言之，將細(xì)胞收集到的裂解緩沖液和超聲處理，細(xì)胞裂解物 中的胱天蛋白酶 3活性用熒光測定通過以下所述基板的切割所測量 209。芐氧羰基 DEVD氨基 4 甲基香豆素。 線粒體細(xì)胞色素 c釋放 收獲細(xì)胞并重新懸浮在透化緩沖液（ 200微克 /毫升的毛地黃皂苷和 80mM的氯化鉀溶于 PBS中）。 5分鐘后，在冰上溫育后，將樣品 以 1000g離心 5分鐘。上清液（細(xì)胞質(zhì)部分）轉(zhuǎn)移到緊接新管和沉淀（線粒體）再懸浮在 RIPA緩沖液。這兩個分?jǐn)?shù)都那么進(jìn)行免疫印跡細(xì)胞色素 C的分析。蛋白質(zhì)含量采用 Lowry等人的方法進(jìn)行測定。 （ 1951）。 無細(xì)胞體系 TR1的抑制作用 1） 抑制反應(yīng)進(jìn) 行在 100mM磷酸鉀緩沖液， ，含有 2mM EDTA和 1毫克 /毫升的牛血清白蛋白。 2） mol重組大鼠 TR1， 250微 mol的 NADPH， 2微 mol的 NQ02，和 200微 mol的 NRH的混合物在上述緩沖液中孵育，在室溫溫度下保持 5分鐘。 3） 然后，不同濃度的 IQs分別為加入（該混合物的終體積為 150微升）， 30min內(nèi)，每5分鐘取 20 微升樣品，測量 TR1活性，采用 DTNB還原法，如先前所描述的（ Fang等人，2022）。 4） 活性測定混合物含有 100mM的磷酸鉀緩沖液， ， 2mM EDTA 的， 1毫克 /毫升牛血清白蛋白， 250 M + NADPH和 DTNB。 TNB從 DTNB的釋放的測定是加樣品測
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