《酶分子修飾壓縮》ppt課件-文庫吧
2024-12-24 05:48 本頁面
【正文】 共價(jià) )的過程 ? 修飾劑的選擇 ：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（ PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（ Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要 根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性 選擇適宜的水溶性大分子。 ? 修飾劑的活化 ：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過 活化 ，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。 ? 修飾 ：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例 混合 ，在一定的溫度、 pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。 ? 分離 ：需要通過 凝膠層析 等方法進(jìn)行分離，將具有 不同修飾度的酶分子 分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。 應(yīng)用最廣的修飾劑 ? 聚乙二醇 是線性分子，溶解度高，具有良好的生物相容性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無抗原性，分子末端有可活化的羥基，活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。 ? 可用多種不同試劑活化，修飾不同基團(tuán) 聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亞胺 聚乙二醇馬來酸酐、聚乙二醇胺 ? 將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸的修飾方法稱為 氨基酸置換修飾 (四 ) 氨基酸置換修飾 ? 氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用 化學(xué)修飾方法 例如， Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的 絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸 ，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法 難度大，成本高，專一性差 ，而且 要對酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾 ，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。 ? 現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是 定點(diǎn)突變技術(shù) 。定點(diǎn)突變（ site directed mutagenesis）是20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在 DNA序列中的某一 特定位點(diǎn) 上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ Protein Engineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了 先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。 定點(diǎn)突變過程 酶分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)（根據(jù)已知的酶結(jié)構(gòu)和其存在的問題） 突變基因序列的確定（考慮物種差異） 突變基因的獲得（ DNA合成儀＋ PCR） 新酶的獲得（重組、轉(zhuǎn)入宿主、表達(dá)） （五）金屬離子置換修飾 ? 概念 ? 作用范圍 ? 常用金屬離子 ? 方法步驟 概念 ?通過改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。 作用范圍 ?含有金屬離子的酶 金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對酶的活性起重要作用。 （ 1 ）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。 （ 2 ）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。 常用金屬離子 ?（往往是二價(jià)離子） :Ca 2+， Mg 2+，Mn 2+， Zn 2+， Co 2+， Cu 2+， Fe 2+等。 金屬離子置換修飾的過程 ? a. 酶的分離純化 ：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。 ? b. 除去原有的金屬離子 ：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（ EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與 EDTA等形成 螯合 物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將 EDTA金屬螯合物從酶液中 除去 。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。 ? c. 加入置換離子 ：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。 ? 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。 ? 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。 （六）親和修飾 ?親和標(biāo)記是一種特殊的化學(xué)修飾方法，它利用酶與底物的親和能力，使用與底物或配體結(jié)構(gòu)類似的修飾劑，對酶活性中心上的氨基酸殘基進(jìn)行共價(jià)修飾修飾。 二、酶修飾后的性質(zhì)變化 ? 熱穩(wěn)
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