《藥物化學(xué)復(fù)習(xí)》ppt課件-文庫吧
2024-12-21 18:35 本頁面
【正文】 缺點： ? （ 1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用； ? （ 2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； ? （ 3）必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性 。 放射免疫性檢測 (RIA， Radioimmunoassay） ? 放射免疫性檢測 (RIA， Radioimmunoassay)的基本原理是 ? 利用標記抗原 (Ag* )和非標記抗原 (Ag)對特異性抗體 (Ab)發(fā)生競爭性結(jié)合，用已知不同濃度的標準物和一定量的 Ag*及限量的 Ab反應(yīng)，采取一定方法將Ag*Ab與 Ag*分開，即可算出該標準物在各濃度下Ag*Ab復(fù)合物的結(jié)合百分率。 ? 然后，加入要篩選的目標物在標準曲線上即可查出樣品中是否含有要篩選的目標物及其濃度。 親和閃爍檢測法 Scintillation Proximity Assay, SPA 該技術(shù)使用能產(chǎn)生冷光的特制平板或圓球微粒，其底部或外層包被著連接分子，通過化學(xué)處理可使抗體、受體蛋白質(zhì)和酶偶聯(lián)到含閃爍的微球體（熒光微球體或 SPA）的表面上，當其和同位素標記的配體特異性結(jié)合，近距離釋放射線能量激發(fā)產(chǎn)生冷光，繼而被探測器所監(jiān)測；不能特異性結(jié)合的小分子，其標記同位素所發(fā)出的射線能量大部分被水溶液散射，而不足以激發(fā)產(chǎn)生冷光?？墒褂瞄W爍計數(shù)器方便地測定。 ? Homogeneous Assays ? Onepot assays with no transfer or wash steps ? All the reagents are added in one step or in multisteps ? The signal is read in a plate reader ? Heterogeneous Assays ? 多步篩選： multiple additions/incubations/washings/ ? transfers/filtrations/readings of the signal ? Labor intensive, plicated step, hard to automate SPR基本原理 它利用 P偏振光在玻璃與金屬薄膜界面處發(fā)生全內(nèi)反射時滲透到金屬薄膜內(nèi)的消失波 ,引發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體 , 當表面等離子體與消失波的頻率相等時 ,二者將發(fā)生共振 ,界面處的全反射條件將被破壞 , 呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象 ， 入射光被 金屬表面電子吸收 ,使反射光能量急劇下降 SPR的優(yōu)點 1. 待測物無需標記 2. 適用于混濁、不透明或者有色溶液 3. 能實時、連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程 4. 檢測方便、快捷 5. 應(yīng)用范圍廣，檢測靈敏度高 6. 始終保持生物分子的活性 SPR缺點 1. 難以區(qū)分非特異性吸附 2. 對溫度、樣品組成等干擾因素敏感 3. 多步結(jié)合和多價結(jié)合的干擾 4. 空間位阻效應(yīng) 5. 配體或者分析物的不均一 6. 擴散速度的限制 7. 重結(jié)合現(xiàn)象 SPR的應(yīng)用 ?對生物分子進行識別及定量檢測 ?研究生物分子間的相互作用 用 SPR可獲得的信息： 1. 兩個分子之間結(jié)合的特異性 2. 目標分子的濃度 3. 結(jié)合以及解離過程的動力學(xué)參數(shù) 4. 結(jié)合的強度 報告基因檢測 ? 報告基因檢測（ report gene assay） ? 報告基因 (reporter gene) ? 是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。 ? 報告基因的特點： ? (1)已被克隆和全序列已測定； ? (2)表達產(chǎn)物在受體細胞中不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細胞中無相似的內(nèi)源性表達產(chǎn)物； ? (3)其表達產(chǎn)物能進行定量測定。 報告基因的種類 ? 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 ? 半乳糖苷酶 ? 人生長激素 ? 熒光素酶 ? 熒光蛋白 熒光產(chǎn)生的原因 ? 原子熒光光譜 的產(chǎn)生 氣態(tài)自由 原子吸收 光源的特征輻射后，原子的外層電子躍遷到較高能級，然后又躍遷返回基態(tài)或較低能級，同時發(fā)射出與原激發(fā)波長相同或不同的發(fā)射即為原子熒光。原子熒光是光致發(fā)光，也是二次發(fā)光。當激發(fā)光源停止照射之后，再發(fā)射過程立即停止。 時間分辨熒光（ HTRF） ? 一般熒光技術(shù)的缺點是熒 RF光壽命短，背景熒光高，激發(fā)光和發(fā)射光容易相互干擾 ? HTRF主要是利用堿土金屬壽命長的特點，可以在激發(fā)和檢測之間延緩一段時間，使具有不同熒光壽命的物質(zhì)達到分別檢測的目的。同時通過熒光諧振能量傳遞原理，區(qū)分開激發(fā)光和發(fā)射光 ? 熒光偏振（ Fluorescence Polarization， FP） ? 1926年 Perrin首次在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。以一束單一波長的偏振光照射溶液中的熒光物質(zhì)，后者可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光。如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于靜止狀態(tài)，該物質(zhì)仍將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運動狀態(tài)，該物質(zhì)發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂熒光去偏振現(xiàn)象。當熒光染料被單極光激發(fā)釋放熒光，產(chǎn)生水平和垂直方向光束。水平和垂直方向光通量的比值即為偏振值（ mP）。 mP大小主要由熒光物質(zhì)分子旋轉(zhuǎn)速度決定，而旋轉(zhuǎn)速度與分子大小呈反比。小分子熒光染料與其他分子結(jié)合后，分子量增加而旋轉(zhuǎn)速度降低，則熒光偏振值（ Mp）升高；相反，如小分子熒光染料從已結(jié)合的分子上解離，則熒光偏振值降低。由于 FP 直接檢測水平和垂直方向光通量比值， Mp 值不受絕對熒光強度的影響，具有操作簡單、快速；分析結(jié)果穩(wěn)定；成本低、高通量和易于自動化等優(yōu)點。 ?酶聯(lián)免疫吸附 (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay , ELISA) ? 使抗原或
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