【正文】 HIV1陽性（任何兩個中有二條帶（ P24 gp41 gp120/gp160） , HIV2無陽性 ? WHO : HIV 1 陽性（不管有無核心帶或酶帶， 但有兩條膜帶） HIV2陽性（不管有無核心帶或酶帶，單有兩條膜帶即為陽性） 18 基因工程酶及其融合蛋白 ? 除了基因工程抗原、抗體外，與標記免疫測定有關(guān)的另一中重要的基因工程試劑就是酶及其融合蛋白，以重組酶建立免疫測定方法較為成功的是CEDIATM均相酶免疫試驗。 ? 使用基因工程酶技術(shù)生產(chǎn)免疫測定標記酶 ，是得到符合標記要求的高純度酶的一條新途徑，但如以其他蛋白（抗原或抗體）融合的方法， 不但避免了繁瑣且低效率的酶與蛋白的化學交聯(lián)，而且無需得到純化的酶和抗原或抗體 。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，將有越來越多的酶免疫測定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基礎(chǔ)之上。 19 發(fā)展趨勢如下 ： ? 1）、由單一病原蛋白向多決定簇融合蛋白轉(zhuǎn)變，并盡可能包括病原體基因組功能區(qū)的所有的能引起肌體免疫應(yīng)答的決定簇。 ? 2）、表達的抗原將盡可能少含有非特異性抗原 或共同抗原。 ? 3）、為某一目的如病原體基因型確定而設(shè)計表達特定的多肽抗原片斷。 ? 總之，將圍繞改善免疫測定的特異性和敏感性來制備基因工程片斷。 20 二、 試劑盒的方法學設(shè)計 ? 目前， ELISA的測定模式，主要有雙抗體夾心法測定抗原，如HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等；間接法測定抗體如 HCV ,抗 HIV 等；雙抗體夾心法測抗體如 HBs，競爭法測抗體，如 HBe,抗 HBc等；競爭法測抗原，如激素等小分子。固相捕獲法測 IgM抗體等，這里只簡述雙抗夾心法測抗原。 目前有一步法和二步法之分 。 21 HBsAgELISA法： ? 一步法：在加入待測物的同時加入酶結(jié)合物一起溫育，一步即完成反應(yīng)過程，一步法 ELISA的反應(yīng)曲線為鐘型曲線 (見圖 1)，也就是說測定隨著待測物中抗原濃度的增加而升高至一定后，測定吸光度即隨抗原濃度的增加而開始下降直至不顯色，即所謂的 “ 鉤狀效應(yīng) ” (HOOK effect)，也就是我們在免疫沉淀實驗中所稱的 “ 帶現(xiàn)象 ” 。 ? Ab+Ag+Ab*→ AbAgAb*+AbAg+AgAb*+Ab*AgAb* (a) (b) (c) (d) 22 ? 其中 a為最后測定結(jié)果的顯色源 ，當待測物中 Ag濃度增加時，無疑會使 b,c,和 d復(fù)合物增加，從而消耗有限的 Ab*,使 a復(fù)合物相應(yīng)減少，顯色降低， 吸光度對抗原濃度的變化曲線成鐘型曲線，而且由于d復(fù)合物的形成，使得在同樣的 Ab*濃度下，一步顯色較二步法為淺 “ 鉤狀效應(yīng) ” ，現(xiàn)已有進展，即采用包被為一種抗體，酶標記用空間距離較遠的決定簇的抗體，同時在操作中充分混勻反應(yīng)液，并適當延長溫育時間，則可使b,c和 d復(fù)合物減少到最低程度，而不出現(xiàn) “ 鉤狀效應(yīng) ” 23 圖 1 一步法 ELISA抗原濃度與顯色 變化的反映曲線 24 二步法： ? 隨著待測物中抗原濃度的逐步增加，將使固相抗體與抗原的結(jié)合逐步達到飽和 (見 1式 )， 這樣在一定濃度 Ab*的存在下，AbAg復(fù)合物的形成將直接與 Ab*結(jié)合 (見 2式 )，抗原濃度的逐步增加導(dǎo)致了顯色的逐步加深， 而形成 S形變化曲線 (見下圖 2)： Ab+Ag→ AbAg (1) AbAg+Ab*→ AbAgAb* (2) ? 綜上所述，一步法 ELISA試劑盒作為適合臨床實驗室簡便快速要求的產(chǎn)物，有著巨大市場，其雖有潛在缺陷，易導(dǎo)致高濃度待測物的標本檢測為假陰性，但精心的實驗設(shè)計，對包被和酶標記抗體的仔細選擇，完全可以將 “ 鉤狀效應(yīng) ” 出現(xiàn)的可能性降至最低。 25 圖 2 二步法 ELISA抗原濃度與顯色 變化的反映曲線 26 灰區(qū)概念：合并二種方法 ? 一步法試劑其反應(yīng)平衡點為圖中反應(yīng)曲線 A點 ,處在抗原抗體反應(yīng)的上坡圖中，故受反映條件的改變而影響 A值 ? 二步法抗原抗體反應(yīng)已達反應(yīng)的平臺期 ? 從圖見一步法 A點則受反應(yīng)條件的改變而影響 A值。因此出現(xiàn)△ Al(可能是假陽性 )，△ A2(可能是假陰性 )。因此將 A1—A2間的區(qū)域稱為灰區(qū)。 27 灰區(qū)的設(shè)置有二種方法 ： ? 以試劑批內(nèi) CV值（一般為 15%左右）設(shè)定，灰區(qū)范圍為 CO（ 1+CV） ? 以試劑盒用臨界值血清測定 S值來設(shè)定，公式為 CO+2S。 ? 以上一般以 S值確定的灰區(qū)范圍比 CV值確定值要大。凡灰區(qū)范圍內(nèi)的結(jié)果可報告可疑或重復(fù)檢測。 28 ? 目前市場上也有一步法和二步法兩種。，一步法存在以下三個問題： ? ①鉤狀效應(yīng)（ Hook Effect）：有漏檢傾向 29 ② HIV2型抗體的檢測： ? P1 P20兩個 HIV2型抗體強陽性標本的檢測中，二步法試劑盒 OD值至少比一步法試劑高出 3~5倍。 30 （ 3） .本底 ? 與一步發(fā)試劑盒相比，因二步法試劑盒標本孵育時間長。酶結(jié)合物反應(yīng)充分，特異性強，不僅抗 HIV 2型陽性標本 OD值比一步法高而且本地清晰。一般二步法本地 。 31 三、 儀器的質(zhì)量控制 ? 隨著全自動生化分析儀的不斷更新發(fā)展，目前國內(nèi)已有多家引進先進的自動化酶免疫分析儀來替代ELISA法的手工操作，使試驗的特性更加全面規(guī)范化。 ? 全自動酶免分析儀的特點 ①、加液的精密度： ②、始終如一的洗滌： ③、環(huán)境控制： ④、 QC特性 /過程安全性 32 酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制 ? 移液器 ? 水浴箱 ? 洗板機 33 ? 酶標儀的簡易校準和質(zhì)量控制 濾光片波長精度檢查 通道差和孔間差檢測 零點漂移即儀器穩(wěn)定性觀察 精密度評價 線性測定 雙波長測定評價 34 四、開展質(zhì)量控制前的準備 ? 檢驗工作的質(zhì)量控制應(yīng)包括實驗室工作的全過程，只有建立在完善的 質(zhì)量管理工作基礎(chǔ)之上，才能對測定結(jié)果進行質(zhì)量控制。沒有健全的 實驗室質(zhì)量管理、質(zhì)量體系，一切均在非控制之中，只靠一份質(zhì)控血清，分析這份血清的質(zhì)控結(jié)果是達不到質(zhì)量保證的預(yù)期結(jié)果的，也不可能做好室內(nèi)質(zhì)控，作好質(zhì)控圖。 35 建立質(zhì)量體系 ? 建立質(zhì)量管理，編制質(zhì)量手冊，健全質(zhì)量體系，使實驗室的工作有條不紊，從樣品采集、運送、記錄、檢測方法的選擇、試劑、儀器、人員素質(zhì)、操作技術(shù)水平、計算、質(zhì)控方法、報告填寫、實驗環(huán)境、工作量、相互協(xié)作等等，每一步驟都準確按質(zhì)量手冊的規(guī)程辦，可預(yù)防差錯，即使偶爾發(fā)現(xiàn)失控，就能容易地分析出產(chǎn)生變異的因素。 36 質(zhì)控血清的制備 ? 各實驗室可以按美國 CAP或國家檢定新的標準建立起定值質(zhì)控品 ? 制備方法： （ 1）收集血清 （ 2）滅活 （ 3）離心或過濾除去沉淀物 （ 4）稀釋 （ 5）保存 （ 6）定期校正 37 HBsAg標準曲線圖 1 2 5 10 ng/ml 38 3質(zhì)控物定值的選擇 ? 室內(nèi)質(zhì)控點的選擇，以需要設(shè)置質(zhì)控的點，設(shè)置質(zhì)控物進行質(zhì)控為原則。 ? 病毒性肝炎酶免疫檢驗中，有高值、中值、低值的質(zhì)控物，我們認為其中以低值的質(zhì)控物為最重要， 設(shè)置臨界于 cutoff值（ CO值 ）的低值弱陽性質(zhì)控物是室內(nèi)質(zhì)控的關(guān)鍵 。重點抓住低值弱陽性 臨界值血清的室內(nèi)質(zhì)控檢測，是室內(nèi)質(zhì)控精密度觀測的最敏感的窗口，也是揭示試驗成功與否的重要標志。 39