齊口裂腹魚gth-rⅱ基因的克隆及其序列分析—論文終-文庫吧
2025-05-18 13:21 本頁面
【正文】 中類固醇激素的生成及間質(zhì)細(xì)胞的分化，在精子發(fā)生的最后幾個(gè)時(shí)期起主要作用 [911]。對其它魚的研究表明， GtHⅡ在體內(nèi)的重要生理功能由促性腺激素Ⅱ受體 (Gonadotropin Hormone Receptor Ⅱ ,GtHRⅡ )介導(dǎo)，性腺中 GtHⅡ主要在排卵前期濾泡的膜細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層以及精巢的間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá) [1214]。 目前，編碼 FSH和 LH這兩種受體的基因 已經(jīng)從一些硬骨魚類的性腺中得到克隆，例如 羅非魚 （ Oreochromis niloticus） 、斑點(diǎn)叉尾鮰 （ Letulurus pinctatus） 、非洲鯰魚 （ Clarias gariepinus） 、斑馬魚 （ Danio rerio） 、日本鰻鱺 （ Anguilla japonica） 、草魚（ Ctenopharyngodon idellus ）和 鳙魚 （ Hypophthalmichthys 3 nobilis） 等 [15]。 令人感興趣的是，魚類中 GtHⅡ基因除了在性腺中有豐富的表達(dá)外，在非性腺組織中也有少量或微量表達(dá) [3,16]；但迄今為止還尚未見有對齊口裂腹魚 GtHRⅡ 基因的克隆及序列研究，因此，本試驗(yàn)通過 對齊口裂腹魚 GtHRⅡ 基因 的克隆及序列分析 ，闡明促性腺激素受體在齊口裂腹魚生殖周期的生理作用 , 以期為闡明齊口裂腹魚繁殖調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。 1 材料與方法 試 驗(yàn)材料 選取的齊口裂腹魚平均體 長為 30～ 40cm； 平均體重為 ～。采集 齊口裂腹魚垂體樣品，置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩? 試劑和儀器 DNA回收試劑盒、 pMD18T載體、 DL2021 bp DNA Marker，反轉(zhuǎn)錄酶和 Taq酶購自寶生物公司； 80℃ 低溫冰箱 (Thermo)、 PCR儀(BioRad)、高速冷凍離心機(jī) (Thermo)、凝膠成像系統(tǒng) (BioRad)、DYYIII68型穩(wěn)壓流電泳儀、紫外分光光度計(jì) (Shimadzu)。 Typtone、Yeast Extract、 NaCK瓊脂糖、瓊脂粉、氨節(jié)青霉素、 IPTG、 XGal、DEPC及其他生物試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。 本實(shí)驗(yàn)引物由 華大基因 有限公司合成。 總 RNA的提取 用 Trizol 法按照試劑盒說明書的步驟提取總 RNA，本實(shí)驗(yàn)所用離心管、槍頭和水均經(jīng) %焦碳酸二乙酯（ diethyl pyrocarbonate， DEPC）過夜處理，高壓滅菌后烘干處理。用 DEPC 4 處理水配置溶液。提取時(shí)取出樣品后立即在低溫下研磨裂解組織，本實(shí)驗(yàn)提取 RNA 的過程要求快速準(zhǔn)確，避免總 RNA 的過度降解，試驗(yàn)操作過程中要 保證無菌，帶上口罩，手套確保 RNA 不被核酸酶降解。 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) NCBI上斑馬魚 GtHRⅡ的 cDNA序列，選取保守區(qū)序列，運(yùn)用Premier 軟 件 設(shè)計(jì) 引物 。 GtHRⅡ 基因 上 游引 物為 5′CATCCGTCGAGGACACTTTCGGTA3 ′，下游引物為 5 ′ACACATAGCATCCGCAAATCACGAG3′， PCR產(chǎn)物長度為 696 bp。委托 華大基因科技 有限公司進(jìn)行特異性引物合成。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄按 Invitrogen 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行，得到的cDNA 置于 20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜?PCR 擴(kuò)增；此次 采用Invitrogen 公司生產(chǎn)的 MMLV 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 PCR擴(kuò)增目的基因片段 以 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測結(jié)果對擴(kuò)增條件作進(jìn)一步調(diào)整，以獲得最佳的目的片段。最終確認(rèn)PCR 產(chǎn)物后，將擴(kuò)增效果最好的樣品產(chǎn)物用于膠回收。 PCR產(chǎn)物回收及克隆測序 用 Omega凝膠回收試劑盒純化回收 PCR產(chǎn)物，將稀釋的 DNA保存在20℃冰箱中備用。將 PCR回收產(chǎn)物導(dǎo)入到 pMD18T載體中，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中 進(jìn)行復(fù)制， 經(jīng)酶切、 PCR鑒定， 然后將克隆的產(chǎn)物送華大 5 基因公司測序。 序列分析 測序產(chǎn)物經(jīng) NCBI網(wǎng)站上的 VecScreen軟件修剪載體序列，獲得GtHRⅡ 基因編碼區(qū)序列，應(yīng)用 Blast軟件進(jìn)行相似性比對。 利用BioEdit軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)組成、疏水性以及抗原決定簇等相關(guān)分析；利用 HNN在線軟件分析預(yù)測氨基酸的二級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用 預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)。 2 結(jié)果與分析 總 RNA提取 以 齊口裂腹魚垂體組織 提取 齊口裂腹魚垂體組織 基因組總 RNA采 用常規(guī)酚 氯仿抽提法， 1%瓊 脂糖凝膠下電泳 抽提產(chǎn)物 ，并于 紫外透射儀上進(jìn)行觀察，然后在 凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描，從圖 1 可見齊口裂腹魚垂體組織 基因組總 DNA 條帶明亮、整齊無拖帶。 其中 28S RNA 和 18S RNA 的條帶亮度比值約為 l～ 2:1， 表明 28S 的條帶比 18S的條帶亮度高，總 RNA 降解較少；抽提基因組 RNA 的純度和濃度均滿足 PCR 擴(kuò)增 要求。 圖 1 齊口裂腹魚垂體組織總 RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖 Fig. 1 Total RNA 1% agarose gel electrophoresis of Schizothorax prenanti pituitary tissue 6 RTPCR產(chǎn)物檢測 圖 2 齊口裂腹魚 GtHRⅡ 基因 PCR電泳檢測圖 Marker: DL2021 GtHRⅡ 基因引物 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 Fig. 2 Electrophores
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