【正文】 rs,IGFs）系統(tǒng)在正常生理活動中起著極為重要的作用，其與胚胎分化、個體發(fā)育密切相關，而且參與糖、脂肪和蛋白質的代謝[11]。IGFBPs是IGFs的重要組成之一，IGFBPs對于調節(jié)IGFs的生物學功能主要表現(xiàn)在以下四個方面： (1)IGFs運載蛋白的作用，并可調節(jié)血液中游離IGFs含量；(2)延長IGFs的半衰期，調節(jié)IGFs的代射清除率；(3)對特異性組織、細胞進行識別和定位；(4)調節(jié)IGFs的生物學效應，通過調節(jié)IGFs和IGFs受體的相互作用來完成；(5)不用依賴于IGFs而直接調節(jié)正常和惡性細胞的生長[1215]。目前發(fā)現(xiàn)IGFBPs家族有6個成員，分別命名為IGFBP1～6。IGFBPs在氨基酸結構上高度保守，在總蛋白質中有35%左右氨基酸是同源的。IGFBPs具有一些共同結構和特征，都能與IGFs結合，同源性較高。它們在人體組織和器官中分布不同，雖然都能與 IGFs結合，但產(chǎn)生的生物學作用也不盡相同[16]。 IGFBPs的結構和功能IGFBPs成熟蛋白均由200～300個氨基酸殘基組成，其中20～40個氨基酸殘基形成信號序列，并含有18個半胱氨酸殘基，組成9對鏈內二硫鍵。如果把IGFBPs平均分成三個區(qū)，即N端區(qū)、中間區(qū)、C端區(qū)，則其中12個Cys分布在N端區(qū)，另6個分布在C端區(qū)，但N端區(qū)和C端區(qū)之間無二硫鍵連接[16]。上述氨基酸的排列相當保守，表明二硫鍵在形成高親和力的IGFs位點中起重要的作用。但也有例外，在人和鼠中IGFBP6分別缺乏2個和4個氨基酸；而IGFBP4則含有20個半胱氨酸殘基。在N端區(qū)域中，IGFBPs存在保守的GCGCCxxC模體，但IGFBP6為GCAEAEGC結構，該結構的意義還不清楚。另外IGFBPs的成員一些特殊結構，IGFBP36均有糖基化現(xiàn)象，除IGFBP6的糖基化位點在C端外，IGFBP35均位于肽鏈中間區(qū)[17]。IGFBP12結構中沒有糖基化的現(xiàn)象，但在其C端區(qū)域均保留有ArgGlyAsp(RGD)一致序列。IGFBP6參與生長、發(fā)育、生殖及血糖等生理過程，是一個多功能蛋白。在人和豬上IGFBP6研究較多。人IGFBP6的研究主要集中于腫瘤的抑制。顧以韌等[18]采用熒光定量PCR技術檢測了長白豬和梅山豬的背最長肌組織中IGFBP6 基因的表達豐度，研究結果顯示IGFBP6基因在兩豬種中表達模式相似，均在4月齡時表達量達到最高后出現(xiàn)極顯著下降。這些都證明了IGFBP6在肌肉的生長中具有重要的作用。而在山羊研究的比較少。針對于其與IGFII高親和力的特點，可以推測其可能的生物學作用。近幾年研究也表明，IGFII在胎兒生長發(fā)育，腫瘤細胞增殖和肌肉生長等方面具有重要調控作用，是影響山羊產(chǎn)肉量的主要候選基因。IGFII在生長發(fā)育中具有重要作用，IGFBP6可能通過與IGFII結合而間接影響生長。2 本研究的目的和意義本研究采用基因克隆、實時熒光定量等現(xiàn)代分子生物學技術，以我國培育的第一個肉用山羊品種——南江黃羊為研究對象, 克隆南江黃羊IGFBP6基因CDS區(qū)序列，研究IGFBP6基因在南江黃羊出生后的不同時期以及同一時期不同組織的表達變化規(guī)律，以揭示山羊早期生長發(fā)育的基因調控與表達規(guī)律，為我國肉用山羊的分子標記輔助選擇、品種分子設計以及快速培育肉用山羊新品種（系）提供科學依據(jù)。3 材料與方法 試驗材料 試驗動物試驗動物來自巴中市南江縣南江黃羊育種場，生后0 d選取2頭公羊和2頭母羊，生后30d、生后60 d、生后90 d和生后120 d等4個時間點各選取了3頭公羊和3頭母羊，共28頭羊（見表1）。隨機選取符合時間段的羊宰殺，取其心臟、肝臟、肺臟、背最長肌、半膜肌、臂三頭肌共6個組織。采樣后快速置于液氮中帶回試驗室，放置于80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。? 采樣信息表Table 1 Information of sample日齡Day0d30d60d90d120d雄性Male23333雌性Female23333微量可調移液器；梯度PCR儀；紫外透射儀TMW20；核酸蛋白檢測儀Smart SpecTMPlus；電子天平；水平電泳儀；常溫冰箱；低溫冰箱20 ℃；超低溫冰箱80 ℃，；超凈工作臺；RTPCR儀。 主要試劑盒與試劑Trizol總RNA抽提試劑盒，氯仿、無水乙醇，反轉錄試劑盒，2Taq PCR Master Mix，DNA膠回收試劑盒，克隆載體試劑盒，實時熒光定量PCR試劑盒 試驗方法按照上海生工Trizol總RNA抽提試劑盒（UNIQ10柱式）說明書提取組織總RNA。l%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA質量，對符合要求的總RNA樣品，用核酸蛋白檢測儀在260nm和280 nm下測定吸光度，按A260/ () 評估總RNA樣品純度。檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布綿羊（Ovis aries）的IGFBP6基因的基因登錄號，分別為NM_001134308，并下載其序列。，包括完整的開放閱讀框，設計的引物采用NCBI網(wǎng)站BLAST工具進行比對檢索，驗證引物的特異性，引物信息如表2。引物由大連寶生物公司合成。表2 IGFBP6基因的引物信息表Table 2 Primer pairs designed for IGFBP 6 genes基因Gene引物序列Sequence of primer擴增溫度Tm片段大小LengthIGFBP6F：5AGCTTTGCTGCGACTGCTCT359℃801bpR：5ATGCTCCTGCCAGTGGCCTT3 cDNA第一條鏈合成（1）RNA變性：將模板RNA 65℃水浴5分鐘，立即置于冰上冷卻（對容易形成高級結構的RNA可提高逆轉錄效率）。（2）按照下表的逆轉錄體系配制混合液，徹底混勻，渦旋振蕩時間不超過5秒鐘，簡短離心，并置于冰上，如果要做多個逆轉錄反應，可以將配制好的混合液后分裝在單個反應管中，置于冰上。（3）逆轉錄反應，先37℃，15分鐘；然后98℃，5分鐘（酶失活），反應結束后，將所得的cDNA于20℃保存。表3 RT反應體系Table 3 RT Reaction system試劑名稱體積5RT buffer8181。lRT Eazyme mix2181。lPrimer mix2181。lRNAase Inhibitor2181。lRNasefree H2O18181。l模板總RNA4181。l總體積40181。l根據(jù)已克隆得到的IGFBP6的CDS區(qū)序列，選擇βactin作為內參基因，利用Primer5軟件設計引物，引物由上海生物工程生物技術服務有限公司合成。取所有組織經(jīng)反轉錄得到的cDNA各1181。l，加入到相應的反應體系中，設定退火溫度梯度為55℃65℃，分別對每個基因的熔解曲線進行分析，檢測引物的特異性。同時根據(jù)熔解曲線確定每個基因的最佳退火溫度（Ct值最小）。將產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異目的片段。分別取每個基因（Ct值最小的管）擴增產(chǎn)物溶液10181。l，加入90181。l去離子水進行稀釋，作為原始管。然后從原始管中取稀釋液50181。l，加入45