【正文】 rs,IGFs）系統(tǒng)在正常生理活動(dòng)中起著極為重要的作用，其與胚胎分化、個(gè)體發(fā)育密切相關(guān)，而且參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝[11]。IGFBPs是IGFs的重要組成之一，IGFBPs對(duì)于調(diào)節(jié)IGFs的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在以下四個(gè)方面： (1)IGFs運(yùn)載蛋白的作用，并可調(diào)節(jié)血液中游離IGFs含量；(2)延長IGFs的半衰期，調(diào)節(jié)IGFs的代射清除率；(3)對(duì)特異性組織、細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和定位；(4)調(diào)節(jié)IGFs的生物學(xué)效應(yīng)，通過調(diào)節(jié)IGFs和IGFs受體的相互作用來完成；(5)不用依賴于IGFs而直接調(diào)節(jié)正常和惡性細(xì)胞的生長[1215]。目前發(fā)現(xiàn)IGFBPs家族有6個(gè)成員，分別命名為IGFBP1～6。IGFBPs在氨基酸結(jié)構(gòu)上高度保守，在總蛋白質(zhì)中有35%左右氨基酸是同源的。IGFBPs具有一些共同結(jié)構(gòu)和特征，都能與IGFs結(jié)合，同源性較高。它們?cè)谌梭w組織和器官中分布不同，雖然都能與 IGFs結(jié)合，但產(chǎn)生的生物學(xué)作用也不盡相同[16]。 IGFBPs的結(jié)構(gòu)和功能IGFBPs成熟蛋白均由200～300個(gè)氨基酸殘基組成，其中20～40個(gè)氨基酸殘基形成信號(hào)序列，并含有18個(gè)半胱氨酸殘基，組成9對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵。如果把IGFBPs平均分成三個(gè)區(qū)，即N端區(qū)、中間區(qū)、C端區(qū)，則其中12個(gè)Cys分布在N端區(qū)，另6個(gè)分布在C端區(qū)，但N端區(qū)和C端區(qū)之間無二硫鍵連接[16]。上述氨基酸的排列相當(dāng)保守，表明二硫鍵在形成高親和力的IGFs位點(diǎn)中起重要的作用。但也有例外，在人和鼠中IGFBP6分別缺乏2個(gè)和4個(gè)氨基酸；而IGFBP4則含有20個(gè)半胱氨酸殘基。在N端區(qū)域中，IGFBPs存在保守的GCGCCxxC模體，但I(xiàn)GFBP6為GCAEAEGC結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的意義還不清楚。另外IGFBPs的成員一些特殊結(jié)構(gòu)，IGFBP36均有糖基化現(xiàn)象，除IGFBP6的糖基化位點(diǎn)在C端外，IGFBP35均位于肽鏈中間區(qū)[17]。IGFBP12結(jié)構(gòu)中沒有糖基化的現(xiàn)象，但在其C端區(qū)域均保留有ArgGlyAsp(RGD)一致序列。IGFBP6參與生長、發(fā)育、生殖及血糖等生理過程，是一個(gè)多功能蛋白。在人和豬上IGFBP6研究較多。人IGFBP6的研究主要集中于腫瘤的抑制。顧以韌等[18]采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了長白豬和梅山豬的背最長肌組織中IGFBP6 基因的表達(dá)豐度，研究結(jié)果顯示IGFBP6基因在兩豬種中表達(dá)模式相似，均在4月齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高后出現(xiàn)極顯著下降。這些都證明了IGFBP6在肌肉的生長中具有重要的作用。而在山羊研究的比較少。針對(duì)于其與IGFII高親和力的特點(diǎn)，可以推測(cè)其可能的生物學(xué)作用。近幾年研究也表明，IGFII在胎兒生長發(fā)育，腫瘤細(xì)胞增殖和肌肉生長等方面具有重要調(diào)控作用，是影響山羊產(chǎn)肉量的主要候選基因。IGFII在生長發(fā)育中具有重要作用，IGFBP6可能通過與IGFII結(jié)合而間接影響生長。2 本研究的目的和意義本研究采用基因克隆、實(shí)時(shí)熒光定量等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以我國培育的第一個(gè)肉用山羊品種——南江黃羊?yàn)檠芯繉?duì)象, 克隆南江黃羊IGFBP6基因CDS區(qū)序列，研究IGFBP6基因在南江黃羊出生后的不同時(shí)期以及同一時(shí)期不同組織的表達(dá)變化規(guī)律，以揭示山羊早期生長發(fā)育的基因調(diào)控與表達(dá)規(guī)律，為我國肉用山羊的分子標(biāo)記輔助選擇、品種分子設(shè)計(jì)以及快速培育肉用山羊新品種（系）提供科學(xué)依據(jù)。3 材料與方法 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物來自巴中市南江縣南江黃羊育種場(chǎng)，生后0 d選取2頭公羊和2頭母羊，生后30d、生后60 d、生后90 d和生后120 d等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各選取了3頭公羊和3頭母羊，共28頭羊（見表1）。隨機(jī)選取符合時(shí)間段的羊宰殺，取其心臟、肝臟、肺臟、背最長肌、半膜肌、臂三頭肌共6個(gè)組織。采樣后快速置于液氮中帶回試驗(yàn)室，放置于80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１? 采樣信息表Table 1 Information of sample日齡Day0d30d60d90d120d雄性Male23333雌性Female23333微量可調(diào)移液器；梯度PCR儀；紫外透射儀TMW20；核酸蛋白檢測(cè)儀Smart SpecTMPlus；電子天平；水平電泳儀；常溫冰箱；低溫冰箱20 ℃；超低溫冰箱80 ℃，；超凈工作臺(tái)；RTPCR儀。 主要試劑盒與試劑Trizol總RNA抽提試劑盒，氯仿、無水乙醇，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，2Taq PCR Master Mix，DNA膠回收試劑盒，克隆載體試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒 試驗(yàn)方法按照上海生工Trizol總RNA抽提試劑盒（UNIQ10柱式）說明書提取組織總RNA。l%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA質(zhì)量，對(duì)符合要求的總RNA樣品，用核酸蛋白檢測(cè)儀在260nm和280 nm下測(cè)定吸光度，按A260/ () 評(píng)估總RNA樣品純度。檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中公布綿羊（Ovis aries）的IGFBP6基因的基因登錄號(hào)，分別為NM_001134308，并下載其序列。，包括完整的開放閱讀框，設(shè)計(jì)的引物采用NCBI網(wǎng)站BLAST工具進(jìn)行比對(duì)檢索，驗(yàn)證引物的特異性，引物信息如表2。引物由大連寶生物公司合成。表2 IGFBP6基因的引物信息表Table 2 Primer pairs designed for IGFBP 6 genes基因Gene引物序列Sequence of primer擴(kuò)增溫度Tm片段大小LengthIGFBP6F：5AGCTTTGCTGCGACTGCTCT359℃801bpR：5ATGCTCCTGCCAGTGGCCTT3 cDNA第一條鏈合成（1）RNA變性：將模板RNA 65℃水浴5分鐘，立即置于冰上冷卻（對(duì)容易形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA可提高逆轉(zhuǎn)錄效率）。（2）按照下表的逆轉(zhuǎn)錄體系配制混合液，徹底混勻，渦旋振蕩時(shí)間不超過5秒鐘，簡短離心，并置于冰上，如果要做多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以將配制好的混合液后分裝在單個(gè)反應(yīng)管中，置于冰上。（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，先37℃，15分鐘；然后98℃，5分鐘（酶失活），反應(yīng)結(jié)束后，將所得的cDNA于20℃保存。表3 RT反應(yīng)體系Table 3 RT Reaction system試劑名稱體積5RT buffer8181。lRT Eazyme mix2181。lPrimer mix2181。lRNAase Inhibitor2181。lRNasefree H2O18181。l模板總RNA4181。l總體積40181。l根據(jù)已克隆得到的IGFBP6的CDS區(qū)序列，選擇βactin作為內(nèi)參基因，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生物工程生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取所有組織經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA各1181。l，加入到相應(yīng)的反應(yīng)體系中，設(shè)定退火溫度梯度為55℃65℃，分別對(duì)每個(gè)基因的熔解曲線進(jìn)行分析，檢測(cè)引物的特異性。同時(shí)根據(jù)熔解曲線確定每個(gè)基因的最佳退火溫度（Ct值最小）。將產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異目的片段。分別取每個(gè)基因（Ct值最小的管）擴(kuò)增產(chǎn)物溶液10181。l，加入90181。l去離子水進(jìn)行稀釋，作為原始管。然后從原始管中取稀釋液50181。l，加入45