目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建 (2)-文庫吧
2025-04-20 21:34 本頁面
【正文】 TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 cDNA第二鏈的合成 DNApol dNTPs RNaesH 置換合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失 5‘ ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4DNA ligase cDNA第二鏈的合成 dCTP TdT 引導(dǎo)合成法： 獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5’端序列 5‘ ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略 雙鏈 cDNA的克隆 雙鏈平頭的 cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接， 但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾， 最好是 AT同聚物尾，這樣重組 分子可通過加熱局部變性和 S1核酸酶處理回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口， 以便插入片段回收 cDNA法分離目的基因的基本程序 完備分離程序 提取細(xì)胞總 mRNA， 合成總 cDNA， 將之全部克隆 ， 然后借助于合適的篩選手段找到 目的重組子 篩選時(shí) ， 若使用的是多拷貝載體 ， 則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體 ， 則采用菌落免疫雜交法篩選 完備分離程序適用于 mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子 VIII基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序 特異分離程序 提取細(xì)胞總 mRNA， 瓊脂糖凝膠電泳分離 ， 回收目標(biāo)mRNA， 由此合成雙鏈 cDNA， 然后進(jìn)行克隆 特異分離程序較適用于 mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 cDNA法分離目的基因的基本程序 差異分離程序 利用兩組細(xì)胞 mRNA種類的差異，分離克隆差異 mRNA所對(duì)應(yīng)的 cDNA， 因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠 FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能 差異分離程序 多瘤病毒感染的 FR3T3細(xì)胞 正常的 FR3T3細(xì)胞 總 mRNA 總 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 單鏈 cDNA 提取 mRNA 合成 cDNA 合成第二鏈 克隆 提取 mRNA 共價(jià)交聯(lián) 上柱 原位雜交 病毒誘導(dǎo)表達(dá)的基因 cDNA克隆 cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的 mRNA分子都具有 polyA結(jié)構(gòu) 細(xì)菌或原核生物的 mRNA半衰期很短 mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感， 分離純化困難 僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 C PCR法 5 目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建 PCR（ Polymerase Chain Reaction） 法，又稱為 聚合酶 鏈反應(yīng) 或 PCR擴(kuò)增技術(shù) ，是一種高效快速的體外 DNA聚合程序 使用 PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的 基因或 DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必 需的雙引物 PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理 5‘ 5‘ 目的基因 5‘ 變性 加熱 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 聚合 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加熱 變性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘
法律信息相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1