【正文】 ，并遵守相關(guān)的生物安全管理規(guī)定。 （ 2）紅細(xì)胞凝集和紅細(xì)胞凝集抑制試驗 在 生物安全 Ⅱ 級實驗室里操作，并遵守相關(guān)的生物安全管理規(guī)定。 （ 3）實驗室基本條件：具備進(jìn)行流感病毒分離鑒定所需要的生物安全柜、離心機、 CO2培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、液氮罐、 70℃ 低溫冰箱以及常規(guī)冰箱等配套設(shè)備 。 2．標(biāo)本采集 哨點醫(yī)院監(jiān)測 診室 的 醫(yī)護(hù) 人員 負(fù)責(zé) 采集，或協(xié)助 當(dāng)?shù)?疾控中心 專業(yè)人員采集流感樣病例的鼻咽拭子等標(biāo)本， 采集人員 填寫 “ 流感 /人禽流感 監(jiān)測病例標(biāo)本原始登記送檢表 ”（ 表 2）， 隨同所采集標(biāo)本 送全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室。 （ 1）采樣對象 ： 發(fā)病 3天內(nèi)的 流感樣 病例， 且沒有服用 過 抗病毒藥物。 根據(jù) 就診 ILI 病例數(shù) 的多少， 每家 哨點醫(yī)院 每周 至少 采集 5～ 15份流感樣病例的標(biāo)本。 8 （ 2） 標(biāo)本采集種類包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽 漱液和鼻洗液， 其中咽拭子、鼻拭子采集后，放入含采樣液 4ml 的 采樣管中 ；鼻咽抽取物采集 5ml；咽漱液和鼻洗液采集 10ml。 采集方法 詳 見 附件 5。 （ 3） 標(biāo)本的運輸 ： 標(biāo)本采集后應(yīng)在 4℃條件下， 盡快（ 24小時內(nèi) ） 運送至全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室， 未能 24 小時內(nèi) 送至實驗室的 ， 應(yīng)置 70℃或以下保存，標(biāo)本運輸 方法 詳 見 附件 5。 在縣中心（人民）醫(yī)院采集的流感樣病例標(biāo)本 ， 每日送縣 級 疾 控 中心，置 70℃或以下保存?？h疾控中心根據(jù)標(biāo)本采集的數(shù)量，每兩周 在 凍存 條件下， 24小時內(nèi)送至 距離較近的流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室。 （ 4）全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室 的工作人員 接到標(biāo)本后， 24小時內(nèi) 將 “ 流感 /人禽流感 監(jiān)測病例標(biāo)本原始登記送檢表” （表 2） 錄入 到“中國 流感 /人禽流感 監(jiān)測信息系統(tǒng)” 的“ 流感 /人禽流感 監(jiān)測病例標(biāo)本登記一覽表” （見表 3） 中 。 3．病毒分離 病毒分離 培養(yǎng) 是流感病原學(xué) 監(jiān)測的基礎(chǔ)， 目前 多采用雞胚和 MDCK 細(xì)胞 并用 進(jìn)行流感病毒 分離。近 年 來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)通過雞胚所分離的流感病毒，其抗原性與原始標(biāo)本有所不同，而通過 MDCK 細(xì)胞 所 分離的 流感病毒 ，其抗原性與原始標(biāo)本相似。另外由于“ O”相毒株的重現(xiàn)， MDCK 細(xì)胞對“ O”相毒株的敏感性遠(yuǎn) 高 于雞胚，所以 MDCK 細(xì)胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。 但 MDCK細(xì)胞分離的病毒不 能 用于疫苗生產(chǎn) 。 為減少工作量，可先用 MDCK 細(xì)胞進(jìn)行篩選，陽性后，再將另外一份 － 70℃ 或以下凍存的 原始標(biāo)本用雞胚進(jìn)行病毒分離。 全國流感監(jiān)測網(wǎng) 絡(luò)實驗室 收 到標(biāo)本后，應(yīng)在 24 小時內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本處理和病毒接種 ，不能及時接種的應(yīng)置－ 70℃ 或以下凍存。 （ 1）標(biāo)本的處理：標(biāo)本送至實驗室后， 立即進(jìn)行處理。將 原始標(biāo)本一分為三份 ，一份 （ 40％） 用于雞胚接種，一份 （ 30％） 用于 MDCK 細(xì)胞接種，一份 （ 30％） 保存待復(fù)核。 處理方法詳見 附件 5。 （ 2） MDCK 細(xì)胞的 接種 和收獲 將處理后的標(biāo)本接種 于 已長單層 的 MDCK 細(xì)胞 上， 每日觀察細(xì)胞病變 ，一般為 7 9 天 。 當(dāng) CPE 出現(xiàn) “ +++” ～ “ ++++” 時，即 75％ 100％ 細(xì)胞出現(xiàn)病變時進(jìn)行收獲，收獲之前可將細(xì)胞凍融 1～ 2次 ， 以提高收獲 標(biāo)本的病毒滴度。 即使無 細(xì)胞病變也應(yīng)于 第 7天收獲 。 CPE 出現(xiàn)時間隨感染病毒的型別、 毒株的差異 、 感染量的大小 和 MDCK 細(xì)胞的代數(shù) 而異 ， 一般標(biāo)本接種后 7天還 未 出 現(xiàn) CPE，維持液 經(jīng) HA 試驗 陰性者 ， 繼續(xù) 盲傳 1～2 代 后 ， HA 試驗 仍為陰性者， 則 MDCK 細(xì)胞 病毒分離為陰性， 標(biāo)本 可 棄 去 。 隨 MDCK 細(xì)胞 傳 代數(shù) 的 增加，其對流感病毒的敏感性下降 。 MDCK 細(xì)胞 復(fù)蘇后 連續(xù)傳 1520 代，在間隔期可以用已知滴度的病毒來檢驗 MDCK 細(xì)胞系的敏感性 （ 具體方法見 附件 5） ，若敏感性下降， 即可棄去，復(fù)蘇新細(xì)胞。 （ 3） 雞胚 的接種和 收獲 將處理 后的標(biāo)本接種于 9日齡 雞胚 的 羊膜腔和尿囊腔， 33℃ ～ 35℃ 培養(yǎng) 72小時 。分別收獲 雞胚 尿囊液和羊水 。 經(jīng) HA 試驗 陰性者 ， 將羊水和尿囊液混合， 繼續(xù) 盲傳 1代 （ 72 小時） ，如 仍為 陰性 ， 則雞胚病毒分離為陰性， 標(biāo)本 可 棄 去 。 （ 4）結(jié)果錄入 流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室的工作人員 在完成病毒 分離 后， 24 小時內(nèi) 將 病毒 分離結(jié)果錄入 “中國 流感 /人禽流感 監(jiān)測信息系統(tǒng)” 中的“ 流感 /人禽流感 監(jiān)測病毒分離 、 鑒定結(jié)果登記一覽表” （見表 4） 中。 4． 病毒鑒定 （ 1）紅細(xì)胞凝集試驗（ HA） MDCK 細(xì)胞 或雞胚收獲的 標(biāo)本首先用 雞、 豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞 凝集試驗（ HA），確定病毒滴度， “ O”相毒株采用豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行 HA 試驗， 具體方法見附件 5。 HA 滴度 ≥ 8，進(jìn)行 紅細(xì)胞凝集抑制（ HI）試驗 ； HA滴度 8 者， 繼續(xù)在敏感的 MDCK細(xì)胞系 或雞胚 上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使其 HA 滴度 ≥ 8后，再進(jìn)行 HI測定 。 若 傳 1～ 2 代后， HA滴度仍 8者， 可 應(yīng) 用 B型引物和能區(qū)分 A型流感病毒不同亞型的引物進(jìn)行 RT－ PCR 鑒定 。不具備 RT－ PCR 鑒定能力的 送國家流感中心進(jìn)行分離鑒定。 10 （ 2）紅細(xì)胞凝集抑制（ HI）試驗 HA 試驗完成 后，用國家流感中心每年提供的抗 A（ H1N1）、抗 A（ H3N2）、抗 B（ Victoria 系 ） 和抗 B（ Yamagata 系 ） 4種標(biāo)準(zhǔn)參照血清， 進(jìn)行 紅細(xì)胞凝集抑制（ HI）試驗 ， 確定 病毒 的型 別 和亞型 ， 進(jìn)行 HI 試驗時，需同時進(jìn)行 4種標(biāo)準(zhǔn)抗原對照。 具體方法見 附件 5。 （ 3）流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室的工作人員 在 完成病毒鑒定后，當(dāng)天將鑒定結(jié)果錄入“中國 流感 /人禽流感 監(jiān)測信息系統(tǒng)” 中“ 流感 /人禽流感 監(jiān)測病毒分離 、 鑒定結(jié)果登記一覽表” （見表 4） 。 5．毒株 的管理和 上送 （ 1） 毒株 的保存 管理 ? 包括國家流感中心在內(nèi)的 全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò) 各 實驗室 ， 要對所有流感毒株進(jìn)行登記，應(yīng)用“中國流感 /人禽流感監(jiān) 測信息系統(tǒng)” 填寫“ 流感 /人禽流感 毒株保存記錄表” （見表 5） ，以備復(fù)核。 ? 毒株鑒定完成后，液體毒株應(yīng)在－ 70℃ 及以下保存 3 年，干燥管可以長期保存。分離毒株的原始標(biāo)本保存 6 個月，在收到國家流感中心復(fù)核鑒定 報告 后，方可棄去。 （ 2）上送國家流感中心的毒株種類 ? 自 國家級 流感樣病例監(jiān)測哨點醫(yī)院 網(wǎng)絡(luò) 采樣，所分離的全部毒株； ? 自 非國家級 流感樣病例監(jiān)測哨點醫(yī)院采樣 ， 所分離到的流感病毒，單 向 血凝抑制效價與 國家流感中心提供的 標(biāo)準(zhǔn)參照血清相比 ， 有 4 倍或 4 倍以上差異的毒株； ? 自 非國家級 流感樣病例監(jiān)測哨點醫(yī)院采樣 ，所分離到的流感病毒 ， HA滴度 8，且不具備 RT－ PCR 鑒定能力的毒株 。 ? HA 陽性， 應(yīng)用 當(dāng)年 國家 流感中心 提供的標(biāo)準(zhǔn)參照血清 進(jìn)行 HI 試驗 ， 4種血清的HI 效價均≤ 20的 毒株。 （ 3）毒株 上送的 時限 和要求 ? HA 陽性， 應(yīng)用國家流感中心提供的標(biāo)準(zhǔn)參照血清進(jìn)行 HI 試驗， 4 種血清的 HI 11 效價均≤ 20 的毒株 ，應(yīng)在 HI試驗結(jié)束 后 24小時內(nèi) 送達(dá)國家流感中心； ? 其余毒株在 HI試驗完成 后， 每 2周 送至國家流感中心； ? 全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)各實驗室負(fù)責(zé)填寫“ 流感 毒株送檢單” （見表 6） ， 將毒株 上送至國家流感中心 。監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)中的市 （縣） 級實驗室送檢毒株時 ， 應(yīng) 同時送各省級疾控中心流感實驗室備份。 ? 所送毒株 每份 不少于 3ml，并且無細(xì)菌污染。 ? 任何單位和個人，未經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)，不得與境外直接進(jìn)行毒株交換。 ? 國家流感中心 ：電話： 01063580764，傳真： 01063580764，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感室，北京宣武區(qū)迎新街 100 號，郵編： 100052。 6．毒株的復(fù)核 國家流感中心 收到毒株后， 進(jìn)行流感病毒型和亞型的復(fù)核鑒定。 （ 1） 經(jīng) HA 復(fù)核，滴度 ≥ 8 的，既可進(jìn)行 HI試驗， 一般毒株 2天內(nèi) 完成 復(fù)核 鑒定 ，并將 結(jié)果錄入“中國 流感 /人禽流感 監(jiān)測信息系統(tǒng)” 中的“國家 流感中心 流感 /人禽流感 毒株復(fù)核、鑒定一覽表” （見表 7） ，進(jìn)行反饋。 用國家流感中心每年提供的抗 A（ H1N1）、抗 A（ H3N2）、抗 B（ Victoria 系）和抗 B（ Yamagata 系 ） 4種標(biāo)準(zhǔn)參照血清無法鑒定的特殊毒株， 應(yīng) 盡快 反饋鑒定結(jié)果。 （ 2） 經(jīng) HA 復(fù)核，滴度 8 的，繼續(xù)在 MDCK 細(xì)胞或雞胚上培養(yǎng) 2代，符合 HA 滴度≥ 8 的，可進(jìn)行 HI 試驗。 并在完成當(dāng)天將復(fù)核結(jié)果錄入“中國 流感 /人禽流感 監(jiān)測信息系統(tǒng)” 中的“國家流感中心 流感 /人禽流感 毒株復(fù)核、鑒定一覽表” （見表 7） ，進(jìn)行反饋。 （ 3） 若經(jīng)病毒培養(yǎng) 2 代后， HA 滴 度仍 8 者， 國家流感中心 應(yīng)用 B型引物和能區(qū)分 A型流感病毒不同亞型的引物進(jìn)行 RT－ PCR 鑒定。 （ 4） 國家流感中心在復(fù)核、鑒定完成后， 填寫“ 國家流感中心 流感 /人禽流感毒株復(fù)核 鑒定報告” （表 8） ，向各省和 /或送毒株的全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室 反饋。 流感 病毒抗原性 分析 國家流感中心 對 所分離到的流感病毒 ，采用單向血凝抑制試驗和交叉血凝抑制 12 試驗 進(jìn)行抗原性分析。 （ 1）單向血凝抑制試驗 選擇不同時間 、不同地區(qū) 分離的毒株，采用近幾年抗原性不同的國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)參照血清 及相關(guān)抗原 和 WHO 提供的標(biāo)準(zhǔn)參照血清 及相關(guān)抗原 ， 進(jìn)行單向 血凝抑制試驗。具體方法見 附件 5。 單向血凝抑制試驗 完成后 ，填寫“ 國家流感中心 流感 毒株 單向血凝抑制試驗報告” （見表 9） ， 及時 向各省和 /或送毒株的全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室反饋。 （ 2）交叉血凝抑制試驗 國家流感中心 選擇不同時間 、不同地區(qū) 分離的毒株， 按照 HI 效價是否 與 標(biāo)準(zhǔn)參照血清存在 4倍及以上差異進(jìn)行分組，每組各選擇一定比例的毒株 ， 采用近幾年抗原性不同的國內(nèi) 代表株 和 WHO 公布的疫苗株及其標(biāo)準(zhǔn)參照血清 ，進(jìn)行 交叉 血凝抑制試驗 ，測定抗原比 。 具體方法見 附件 5。 交叉 血凝抑制試驗完成后，填寫“國家流感中心毒株 交叉 血凝抑制試驗 報告”（見表 10） ，及時向各省和 /或送毒株的全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室反饋。 流感病毒基因特性分析 國家流感中心 選擇不同時間、不同地區(qū)分離的毒株， 尤其是抗原比有差異的，按照 HI 效價是否與標(biāo)準(zhǔn)參照血清存在 4 倍及以上差異進(jìn)行分組，每組各選擇一定比例的毒株， 進(jìn)行血凝素重鏈區(qū)（ HA1） 和 N 基因的 核苷酸序列測定，并與當(dāng)年 WHO推薦的疫苗株的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較分析， 完成后及時向各省和 /或送毒株的全國流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室反饋。 七、流感暴發(fā)疫情監(jiān)測 （一）暴發(fā)疫情定義 1．流感樣病例暴發(fā)疫情定義： 在某一相對集中 的區(qū)域內(nèi)（如 村莊、 學(xué)校、幼托機構(gòu)、 敬老院、 工廠、公司 、工地 等集體單位）， 一周內(nèi) ， 出現(xiàn) 30 例及以上 ，或集體單位中 10％以上 的 聚集性流感樣病例。 13 2．流感暴發(fā)疫情：根據(jù)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的分級分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。 （二） 暴發(fā)疫情的發(fā)現(xiàn)與報告 1．疫情發(fā)現(xiàn) （ 1） 各級醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)，發(fā)現(xiàn)本地區(qū) 在某一相對集中的區(qū)域內(nèi)（如村莊、學(xué)校、幼托機構(gòu)、工廠、公司等集體單位）， 短時間內(nèi)出現(xiàn)較多聚集性 的 流感或 流感樣病例，要及時向當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)報告。 （ 2） 各級 疾病預(yù)防控制機構(gòu) ， 要 主動 和當(dāng)?shù)亟逃鞴懿块T聯(lián)系，建立學(xué)校、幼托機構(gòu) 流感 或 流感樣病例聚集性發(fā)病 的 報告渠道 。 各級各類學(xué)校指定 的 負(fù)責(zé)本校傳染病疫情報告工作 的 專人或兼職教師 一旦發(fā) 現(xiàn) 暴發(fā)疫情苗頭，應(yīng)主動向轄區(qū)內(nèi)疾病預(yù)防控制機構(gòu)進(jìn)行報告，疾病預(yù)防控制機構(gòu)應(yīng)及時進(jìn)行調(diào)查和處理。 （ 3） 在當(dāng)?shù)亓鞲辛餍屑竟?jié)，疾病預(yù)防控制機構(gòu) 應(yīng) 定期 開展主動監(jiān)測，以早期發(fā)現(xiàn) 暴發(fā) 疫情。 2． 疫情報告 （ 1） 各級疾病預(yù)防控制機構(gòu)，在接到 流感或 流感樣病例暴發(fā) 疫情報告后，要及時進(jìn)行調(diào)查處理 ， 并在接到疫情報告后 盡快 應(yīng)用 “ 突發(fā)公共衛(wèi)生事件報告管理 信息系統(tǒng) ” ， 進(jìn)行 首次 報告 。 （ 2） 在暴發(fā)疫情調(diào)查處理的 過程 中， 根據(jù)疫情進(jìn)展情況， 及時 在 首次報告 的基礎(chǔ)上 進(jìn)行 進(jìn)程報告 ， 在 暴發(fā)疫情 結(jié)束后 ， 盡快 進(jìn)行 結(jié)案報告 。 （ 3） 符合 《全國突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理預(yù)案》中規(guī)定的突發(fā)公共衛(wèi)生事件分級標(biāo)準(zhǔn) 的流感暴發(fā)疫情 ，則按照相應(yīng)的規(guī)范進(jìn)行報告。 3． 報告內(nèi)容 報告內(nèi)容 主要 包括 事件類別、事件名稱、