【正文】 例）； 100＞ β≥10 ，通常需萃取 10～ 12 次； β≤2 ，需萃取 100次以上； β≌1, 即 KA/KB≌1 ，則無法分離 pH 以酸性物質(zhì)（ HA）為例，其在水中的解離平衡及解離常數(shù) K可用下式表示： 酸性越強， Ka越大， pKa值越小。 堿性越強， Ka越小， pKa值越大。 通常酚類化合物的 pKa值一般為 ～ ，羧酸類化合物的 pKa值約為 5 若使該酸性物質(zhì) 完全解離 ，即使 HA均轉(zhuǎn)變?yōu)?A，則 pH ≌ pKa+2 若使該酸性物質(zhì) 完全游離 ，即使 A均轉(zhuǎn)變?yōu)?HA，則 pH ≌ pKa 2 （游離型極性小，易溶于小極性的有機溶劑；解離型極性大，易溶于水或親水性有機溶劑） ① 若 pH﹤ 3（酸性條件） 酸性物質(zhì)游離態(tài)（ HA），極性小 堿性物質(zhì)則呈離狀態(tài)（ BH+），極性大 ② 若 pH﹥ 12（堿性條件） 酸性物質(zhì)解離形式（ A），極性大 堿性物質(zhì)游離狀態(tài)（ B），極性小 液萃取與紙色譜 液分配柱色譜 將兩相中的一相涂覆在硅膠等多孔載體上作為固定相，填充在色譜管中，然后加入與固定相不相混溶的另一相溶劑作為流動相來沖洗色譜柱。 常用載體：硅膠、硅藻土及纖維素粉等。 常用反相硅膠填料有： RP2（ C2H5）、 RP8（ C8H17）、 RP18（ C18H37） （ 1）正相色譜：固定性極性 流動相極性 被分離物質(zhì)極性越大（親水性越強），越不易洗脫。 固定相： 強極性溶劑 ，如水、緩沖溶液等。 流動相： 弱極性有機溶劑 ，三氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇等。 適用物質(zhì)：水溶性或極性 較大的成分，如生物堿、苷類、糖類、有機酸等化合物。 （ 2）反相色譜：固定性極性 流動相極性 被分離物質(zhì)極性越?。ㄓH脂性越強），越不易洗脫。 固定相：可用石蠟油。 流動相：水或甲醇等強極性溶劑適用物質(zhì)：脂溶性化合物，如高級脂肪酸、油脂、游離甾體等。 （ 3）加壓液相柱色譜（了解，不做重點掌握） 載體：多為顆粒直徑較小、機械強度及比表面積均大的球形硅膠微粒，如 Zipax類薄殼型或表面多孔型硅球以及 Zorbax類全多孔硅膠微球。 快速色譜（ flash chromatography，約 179。10 5Pa）、低壓液相色譜（ LPLC， 179。10 5 Pa）、 中壓液相色譜（ MPLC， 179。10 5～ 179。105Pa ）及高壓液相色譜（ HPLC， 179。10 5Pa）等。 各種加壓液相柱色譜的大體分離規(guī)模 （三）根 據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進(jìn)行分離 物理吸附： 靠分子間力吸附。無選擇性，吸附與解吸附過程可逆，快速。 如硅膠、氧化鋁、活性炭吸附。 化學(xué)吸附： 靠化學(xué)反應(yīng)吸附。有選擇性，吸附牢固，部分不可逆。 如堿性氧化鋁吸附黃酮等酚酸性物質(zhì)。 半化學(xué)吸附： 介于物理吸附與化學(xué)吸附之間，力量較弱。 如聚酰胺對黃酮類、醌類等化合物之間的氫鍵吸附。 —— 極性相似者易于吸附 硅膠、氧化鋁為極性吸附劑 ，特點： （ 1）對極性物質(zhì)具有較強的親和能力。 故同為溶質(zhì)，極性強者將被優(yōu)先吸附。 （ 2） 溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質(zhì)將表現(xiàn)出越強的吸附能力；溶劑極性增強，則吸附劑對溶質(zhì)的吸附能力即隨之減弱。 （ 3）溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強的溶劑時，又可被后者置換洗脫下來。 活性炭因為是非極性吸附劑 ，故與硅膠、氧化鋁相反，特點為： （ 1）對非極性物質(zhì)具有較強的親和能力， 在水中對溶質(zhì)表現(xiàn)出強的吸附能力。 （ 2）溶劑極性降低，則 活性炭對溶質(zhì)的吸附能力也隨之降低。故從活性炭上洗脫被吸附物質(zhì)時，洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的降低而增強。 所謂極性 乃是一種抽象概念，用以表示分子中電荷不對稱（ assymmetry）的程度，并大體上與偶極矩（ dipole moment）、極化度（ polarizability）及介電常數(shù)（ dielectrie constant）等概念相對應(yīng)。 （ 1）化合物結(jié)構(gòu)中官能團的極性強弱： 官能團的極性 （ 2）含官能團的種類、 數(shù)目及排列方式等綜合因素對化合物極性的影響 ① 化合物中所 含正電或負(fù)電等電性基團越多 ，極性越強（如氨基酸強極性）。 ② 化合物所含的 極性基團數(shù)目越多，極性越強 （葡萄糖極性強于鼠李糖）。 ③ 所含 極性基團相同時，非極性基團越多，極性越弱 （如高級脂肪酸極性弱）。 ④ 酸、堿及兩性化合物， 游離型極性弱，解離型極性強 ，存在狀態(tài)可隨 pH 改變。 （ 3）化合物極性與介電常數(shù) 化合物極性大體可依據(jù)介電常數(shù)（ ε ）的大小判斷， ε 越大，極性越強 。 （ 1）用于化合物的精制：結(jié)晶與重結(jié)晶過程中 加入活性炭脫色、脫臭 。 注意：有時擬除去的色素不一定是親脂性的，故活性炭脫色不一定總能收到良好的效果。一般須根據(jù)預(yù)試結(jié)果先判斷色素的類型，再決定選用什么吸附劑處理為宜。 （ 2）用于化合物的濃縮：如活性炭吸附濃縮一葉萩堿。 （ 1）吸附劑及用量 主要吸附劑：硅膠、氧化鋁。 用量：一般為樣品量的 30～ 60倍。 樣品極性較小、難以分離者，吸附劑用量可適當(dāng)提高至樣品量的 l00～ 200倍。 規(guī)格：通常為 100目左右。 如采用加壓柱色譜，還可以采用更細(xì)的顆粒，或甚至直接采用薄層色譜用規(guī)格。 （ 2）拌樣及裝樣 硅膠、氧化鋁吸附柱色譜，應(yīng)盡可能選用極性小的溶劑裝柱和溶解樣品，以利樣品在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。 如樣品在所選裝柱溶劑中不易溶解，則可將樣品用少量極性稍大溶劑溶解后 ,再用少量吸附劑拌勻 ,并在 60℃ 下加熱揮盡溶劑，置 P205真空干燥器中減壓干燥、研粉后再小心鋪在吸附劑柱上。 （ 3）洗脫 洗脫溶劑宜逐步增加，但跳躍不能太大。實踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調(diào)節(jié)比例以改變極性，達(dá)到梯度洗脫分離物質(zhì)的目的。 注意：一般，混合溶劑中強極性溶劑的影響比較突出，故不可隨意將極性差別很大的兩種溶劑混合在一起使用。實驗室中最常應(yīng)用的混合溶劑組合如表所示： 吸附柱色譜常用混合洗脫溶劑 （ 4）添加溶劑的選擇 分離酸性物質(zhì)： 選用 硅膠（顯酸性） ，洗脫溶劑 加入適量乙酸 ，防止拖尾。 分離堿性物質(zhì)： 選用氧化鋁（顯弱堿性），洗脫溶劑加入適量氨、吡啶、二乙胺，防止拖尾。 （ 5）洗脫劑的選擇與優(yōu)化 通過薄層色譜法（ TLC）進(jìn)行篩選 一般 TLC展開 時使組分 Rf值達(dá)到 ～ 統(tǒng)。 基本原理： 氫鍵吸附。 適用化合物類型： 酚類、醌類、黃酮類。 （ 1）聚酰胺的性質(zhì)及吸附原理 性質(zhì)： 商品聚酰胺均為高分子聚合物質(zhì)， 不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、三氯甲烷及丙酮等常用有機溶劑。 對堿較穩(wěn)定，對酸尤其是無機酸穩(wěn)定性較差 ，可溶于濃鹽酸、冰乙酸及甲酸。 聚酰胺色譜的分離機理：一般認(rèn)為是 “ 氫鍵吸附 ” ，即聚酰胺的吸附作用是通過其 酰胺羰基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰 胺鍵上的游離胺基與醌類、脂肪羧酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附 。至于吸附強弱則取決于各種化合物與之形成氫鍵締合的能力。 固定相 移動相 氫鍵： 氫原子與電負(fù)性的原子 X共價結(jié)合時，共用的電子 對強烈地偏向 X的一邊，使氫原子帶有部分正電荷，能再與另一個電負(fù)性高而半徑較小的原子 Y結(jié)合，形成的 X— H┅Y 型的鍵。 X、 Y為氧（ O）、氮（ N）、氟（ F）等電負(fù)性較大，且半徑較小的原子。 吸附強弱通常在含水溶劑中大致有下列規(guī)律： ① 形成氫鍵的基團數(shù)目越多，則吸附能力越強 ② 成鍵位置對吸附力也有影響。易形成分子內(nèi)氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附即相應(yīng)減弱。 如： ③ 分子中芳香化程度高者，則吸附性增強；反之，則減弱。 如： ④ 洗脫溶劑的影響 洗脫能力由弱到強的順序為： 水＜甲醇或乙醇（濃度由低到高）＜丙酮＜稀氫氧化鈉水溶液或氨水＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺（ DMF）＜尿素水溶液 （ 2）聚酰胺色譜的應(yīng)用 ① 對酚類、黃酮類等含酚羥基化合物可逆吸附，分離效果好，吸附容量大，適于制備分離。 ② 可用于生物堿、萜類、甾體、糖 類、氨基酸等其他極性與非極性化合物的分離。 ③ 對鞣質(zhì)的吸附特強，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣處理。 性質(zhì)：一般為白色球形顆粒狀，通常分為非極性和極性兩類， 對酸、堿均穩(wěn)定 。 優(yōu)勢： ① 操作簡便，樹脂可再生； ② 可重復(fù)操作，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，收率恒定； ③ 既能選擇性吸附，又便于溶媒洗脫，且不受無機鹽干擾； ④ 一般不用有機溶媒，既保持傳統(tǒng)的中醫(yī)理論用藥特色，又最大限度的保留了其有效成分。 （ 1）吸附原理： ① 選擇性吸附 （由于范德華引力或產(chǎn)生氫鍵的結(jié)果） ② 分子篩性能 （由其本身的多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)決定） （ 2）影響吸附的因素： ① 大孔樹脂本身的性質(zhì)（比表面積、表面電性、極性、能否形成氫鍵等）。 ② 洗脫溶劑的性質(zhì)（極性、酸堿性）。 ③ 被分離化合物的性質(zhì)（分子量、極性、能否形成氫鍵）。 注：大孔樹脂的色譜行為具有 反相 的性質(zhì)，被分離物質(zhì)的極性越大，其 Rf值越大，越容易洗脫。 （ 3）大孔吸附樹脂的應(yīng)用： 主要用于天然化合物的分離和富集 預(yù)處理方法：用高濃度乙醇濕法裝柱，繼續(xù)用乙醇在柱上流動清洗，不時檢查流出的乙醇液，至流出的乙醇液與 水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象，然后以大量的蒸餾水洗去乙醇即可。 （ 4）洗脫液的選擇： 洗脫液可選擇水、甲醇、乙醇、丙酮、不同濃度的酸堿液等。 一般方法如下： ① 用適量水洗，洗下單糖、鞣質(zhì)、低聚糖、多糖等極性物質(zhì)，用薄層色譜檢識，防止極性大的皂苷被洗下； ②7O% 乙醇洗，洗脫液中主要為皂苷，但也含有酚性物質(zhì)、糖類及少量黃酮，實驗證明 30%乙醇不會洗下大量的黃酮類化合物； ③3% ～ 5%堿溶液洗，可洗下黃酮、有機酸、酚性物質(zhì)和氨基酸； ④10% 酸溶液洗，可洗下生物堿、氨基酸； ⑤ 丙酮洗 ，可洗下中性親脂性成分 注：研究表明，對吸附量真正起作用的是體積比表面積，即每毫升濕樹脂所具有的比表面積。 （ 5）大孔樹脂應(yīng)用的安全性問題： 規(guī)格影響中藥提取液的質(zhì)量 大孔吸附樹脂規(guī)格內(nèi)容包括： 名稱、牌（型）號、結(jié)構(gòu)（包括交聯(lián) 劑）、外觀、極性，以及粒徑范圍、含水量、濕密度（真密度、視密度）、干密度（表觀密度、骨架密度）、比表面、平均孔徑、孔隙率、孔容等物理常數(shù)； 此外還有未聚合單體、交聯(lián)劑、致孔劑等添加劑殘留量限度等參數(shù)。 練習(xí)題 最佳選擇題 大孔吸附樹脂吸附的物質(zhì)用水充分洗脫后，再用丙酮洗脫，被丙酮洗下的物質(zhì)是 [答疑編號 5630010301] 【正確答案】 D （四）根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離 超濾法 —— 利用不同分子量化合物擴散速度不同而分離 超速離心法 —— 離心作用 （凝膠過濾色譜、分子篩過濾、排阻色譜） （ 1）分離原理：分子篩作用， 根據(jù)凝膠的孔徑和被分離化合物分子的大小而達(dá)到分離的目的。 當(dāng)混合物溶 液通過凝膠柱時，比凝膠孔隙小的分子可以自由進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而比凝膠孔隙大的分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能通過凝膠顆粒間隙。 （ 2）凝膠的種類與性質(zhì) 葡聚糖凝膠（ Sephadex）： 只適于在水中應(yīng)用，且不同規(guī)格適合分離不同分子量的物質(zhì)。 羥丙基葡聚糖凝膠（ Sephadex LH20）： 除具有分子篩特性外，在由極性與非極性溶劑組成的混合溶劑中常常起到反相色譜效果。 利用一種用天然或人工合成的膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力，對雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級、提純和富集的方 法。 膜過濾技術(shù)主要包括：滲透、反滲透、超濾、電滲析和液膜技術(shù)等。 透析法：根據(jù)溶液中分子的大小和形態(tài)，在微米（ μm ）數(shù)量級下選擇性過濾的技術(shù)。 常壓下，小分子可通過，大分子不能通過。 按照孔徑大小，可將透析膜分為： 微濾膜（ ～ 14μm ）；超濾膜（ ～ ）；反滲透膜（ ～ ）；納米膜（約2nm） 應(yīng)用：精制藥用酶時，用透析法脫無機鹽。 （五）根據(jù)物質(zhì)解離程度不同進(jìn)行分離 基于混合物中各成分解離度差異進(jìn)行分離。 性質(zhì)：球形顆粒，不溶于水，但可在水中膨脹。 結(jié)構(gòu)： （