【正文】 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 今后應(yīng)重點(diǎn)開展的工作： 論研究。 、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 、細(xì)胞解離容易，并能重復(fù)使 用的新型廉價(jià)的微載體。 ，包括新型的無菌生 物反響器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進(jìn)的在線監(jiān)測、分析與 自動(dòng)控制技術(shù)等。 。 第七十頁，共一百一十二頁。 組織工程 概述 組織工程： 組織工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將人體的某局部組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)、繁殖、擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而到達(dá)器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。 第七十一頁，共一百一十二頁。 修復(fù)缺損器官的方法 修復(fù)缺損器官： 自體移植：“拆東墻補(bǔ)西墻〞 —— 增加患者痛苦、有的器官 獨(dú)一無二而無法移植。 異體移植：最難解決免疫排斥反響，失敗率極高；異體 器官來源有限，供不應(yīng)求，難以實(shí)施移植。動(dòng)物器官移植同樣 存在免疫排斥反響，且有將動(dòng)物的一些病毒傳染給人類的危險(xiǎn) 組織代用品：如硅膠、不銹鋼、金屬合金等，致命弱點(diǎn) 是與人體組織相容性差，不能長久使用，還易引起感染。 第七十二頁，共一百一十二頁。 組織工程修復(fù)缺損器官 采用相容性好的生物可降解材料制成的各鐘三維結(jié) 構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體〔支架〕，在細(xì)胞增殖過程中，提 供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而 自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定 形態(tài)和功能的組織和器官。 其優(yōu)勢明顯、應(yīng)用前景誘人：運(yùn)用生物工程技術(shù)， 利用人體剩余器官的少量正常細(xì)胞進(jìn)行體外繁殖，既 可獲得患者急需的具有相同功能的器官，又無排斥反 應(yīng)，現(xiàn)已取得滿意的成果。 第七十三頁，共一百一十二頁。 組織工程現(xiàn)狀 在進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的再生的和實(shí)驗(yàn)室培育的器官： 骨骼、軟骨、血管、皮膚、胚胎期的胎兒神經(jīng)組織。 正在實(shí)驗(yàn)室里生長成形的：肝臟、胰臟、心臟 乳房、手指、耳朵等。 人們甚至正在嘗試： 培育能充當(dāng)藥物釋放渠道 的組織。 第七十四頁，共一百一十二頁。 組織培養(yǎng) 上皮組織的體外培養(yǎng) 肌肉組織的體外培養(yǎng) 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 第七十五頁，共一百一十二頁。 上皮組織的體外培養(yǎng) 一、體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞生長的形態(tài)特征： 體內(nèi)上皮組織細(xì)胞：排列緊密、形態(tài)較一致、 有極少量的細(xì)胞間質(zhì)、被覆上皮分為單層和復(fù)層上皮 體外培養(yǎng)時(shí)： 〔 1〕局部保存體內(nèi)生長的特征：成群存在或緊密 相連成單層膜，極少離群獨(dú)存，表現(xiàn)群體依賴性 。 〔 2〕接觸抑制：培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞增多成片 后，運(yùn)動(dòng)和生長受到抑制。 第七十六頁，共一百一十二頁。 上皮組織的體外培養(yǎng) 二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 表皮細(xì)胞：角質(zhì)形成細(xì)胞〔角蛋白細(xì)胞，占絕大 多數(shù)〕和非角質(zhì)形成細(xì)胞〔數(shù)量不多，更新慢〕。 角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)較經(jīng)典的方法 —— 飼養(yǎng)層 細(xì)胞培養(yǎng)法〔 Rheinwald 和 Green, 1975〕： 原理及優(yōu)點(diǎn)：將別離的角質(zhì)形成細(xì)胞種植在經(jīng) 過處理的小鼠 3T3滋養(yǎng)細(xì)胞形成的飼養(yǎng)層上，以促進(jìn) 角質(zhì)形成細(xì)胞的生長與分化；細(xì)胞接種密度抵、增殖 快、生長穩(wěn)定、傳代較好。 第七十七頁，共一百一十二頁。 上皮組織的體外培養(yǎng) 二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 實(shí)驗(yàn)材料： 表皮細(xì)胞來源： 外科手術(shù)取包皮、乳腺、腹部皮膚，流產(chǎn) 胎兒皮膚最好，燒傷的依情況定。 飼養(yǎng)層細(xì)胞： 瑞士小鼠胚胎瘤的成纖維細(xì)胞系 3T3，能有 力促進(jìn)表皮細(xì)胞的貼壁生長，抑制混入的成纖維細(xì)胞生長。 3T3細(xì)胞培養(yǎng)液： DMEM加 10%胎牛血清、 4 mmol∕L谷 氨酰胺、青霉素 100 IU∕ml、鏈霉素 100 μg ∕ml。 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 ： DMEM和 F12 (3﹕ 1)加 10%胎牛血 清、 4 mmol∕L谷氨酰胺、青 100IU∕ml、鏈霉素 100 μg ∕ ml、 5 μg ∕ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、 5μg ∕ml胰島素等。 第七十八頁，共一百一十二頁。 培養(yǎng)過程： 〔 1〕 3T3細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：小鼠胚胎瘤成纖維細(xì)胞系 3T3 → PBS平衡液洗滌 → 胰蛋白酶 EDTA消化 → 細(xì)胞變圓〔顯微鏡 下觀察〕 → 棄消化液，加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液〔消化液體積的 3倍〕 → 吹打分散細(xì)胞 → 接種培養(yǎng)， 3~5天發(fā)生融合 → 接近融合 成單層時(shí) → 傳代培養(yǎng)。 〔 2〕飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備： 3T3細(xì)胞覆蓋瓶底一半時(shí) → 換培養(yǎng) 液 → 培養(yǎng) 24h → 接近融合 → 加 1~10 μg ∕ml絲裂霉素 C，培養(yǎng) 12h → 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 3次 → 胰蛋白酶消化 → 種植在培養(yǎng)瓶中 → 加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 →37 ℃ 培養(yǎng) → 貼壁后 12h〔再種植角 質(zhì)形成細(xì)胞〕。 〔 3〕角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代：取材消毒、別離皮膚和 皮下組織，切成 2~3mm小快 → 中性蛋白酶消化〔 4 ℃ 過夜或 37 ℃ 2~4h〕→ 針頭分開表皮〔薄而半透明〕與真皮 → 胰蛋 白酶消化、離心、培養(yǎng) → 細(xì)胞覆蓋 70%瓶底那么傳代。 第七十九頁，共一百一十二頁。 結(jié)果分析： 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng) 3~5天后開始形成集落、擴(kuò)展； 10天左右集落融合形成皮片，細(xì)胞增速減慢； 3T 3漸被排擠，形成整個(gè)皮片時(shí)， 3T3細(xì)胞消失。 第八十頁，共一百一十二頁。 肌肉組織的體外培養(yǎng) 肌肉組織的特點(diǎn)： 又稱肌組織，來自于中胚層具收縮能力的肌細(xì)胞。肌細(xì)胞 間有少量的結(jié)締組織、豐富的血管和神經(jīng)。 肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細(xì)胞在離體環(huán)境中 存活、生長或發(fā)育。肌肉細(xì)胞富含肌原纖維具收縮能力，故培 養(yǎng)方法上有其特殊性。 骨骼肌細(xì)胞：中胚層細(xì)胞分化 → 成肌細(xì)胞 → 有絲分裂 →融合 → 肌管細(xì)胞〔長條管狀，十多個(gè)核串珠狀排列中間〕 →肌原纖 維增加，核向周邊移動(dòng) → 骨骼肌細(xì)胞。 第八十一頁，共一百一十二頁。 肌衛(wèi)細(xì)胞：乃骨骼肌細(xì)胞的干細(xì)胞〔可被看作儲(chǔ)藏 的成體細(xì)胞〕。緊貼骨骼肌細(xì)胞外表，扁平，有突起 能進(jìn)行有絲分裂。肌肉受傷后，肌衛(wèi)細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)化 為肌細(xì)胞，進(jìn)一步分化為肌纖維，填補(bǔ)受傷部位。 成熟的骨骼肌細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂。 第八十二頁，共一百一十二頁。 骨骼肌的培養(yǎng)： 材料：組織來源 —— 胚胎或新生〔 1~2天最好〕大鼠大腿 肌肉；培養(yǎng)液 —— Eagle MEM或 DMEM〔添加 FCS或 ∕和馬血 清、雞胚液〕。 培養(yǎng)過程：〔 1〕處死動(dòng)物，別離大腿肌肉，洗滌，胰蛋 白酶消化，收集懸浮細(xì)胞?！?2〕接種在 10% CO飽和濕度 環(huán)境中培養(yǎng)?！?3〕取原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞記數(shù)，接種在明 膠覆蓋的培養(yǎng)板上，進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)。 第八十三頁，共一百一十二頁。 骨骼肌培養(yǎng)的結(jié)果： 接種數(shù)小時(shí)后多數(shù)細(xì)胞貼壁，主要為單核〔外觀明顯〕細(xì) 胞；前 2天是細(xì)胞增殖的主要時(shí)期，無明顯細(xì)胞融合；50~52 h 后，細(xì)胞進(jìn)入快速融和期；多核細(xì)胞快速生長導(dǎo)致纖維網(wǎng)的形 成；數(shù)天后融合結(jié)束，之后可觀察到纖維的自發(fā)收縮現(xiàn)象；再 過 1~2天，骨骼肌細(xì)胞的特征橫紋開始變得明顯；有時(shí)肉眼可 見到細(xì)胞收縮；適當(dāng)條件下，細(xì)胞增殖一代時(shí)間為 11~13 h。 肌肉細(xì)胞系的建立：肌細(xì)胞的連續(xù)選擇性傳代，低密度接 種到有〔或無〕飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板上，形成單細(xì)胞克隆，可 以防止肌源性表型的過早喪失。〔不同組織來源的細(xì)胞連續(xù)傳 代會(huì)導(dǎo)致生長增殖活動(dòng)停止，也有肌源性表型喪失的趨勢〕 第八十四頁，共一百一十二頁。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞〔神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞〕組成神經(jīng) 組織。即體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 培養(yǎng)對象、條件、設(shè)備等不同，培養(yǎng)方法不同。 差速處理富集脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)法： 材料： 動(dòng)物：胚齡 14天的大鼠胚胎； 培養(yǎng)液：〔 1〕含血清的培養(yǎng)液： DMEM加20%胎 牛血清、 50 IU∕ml的青霉素、 50μg ∕ml 的鏈霉素 〔 2〕無血清的培養(yǎng)液： DMEM 加 5μg ∕ml 牛胰島 素、 50 μg ∕ml 人轉(zhuǎn)鐵蛋白?！?3〕多聚賴氨酸液。 第八十五頁，共一百一十二頁。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 培養(yǎng)步驟： 〔 1〕取大鼠胸、腰段脊髓，剔除脊膜，顯微鏡下別離暗灰色 組織，剪碎； 〔 2〕 37℃ %胰蛋白酶消化 15 min，胎牛血清終止酶活性 后，離心、懸浮、吹打，再離心，制得細(xì)胞懸浮液； 〔 3〕 10ml 細(xì)胞懸液于直徑 100mm培養(yǎng)皿中， 37℃ 、 5%的 CO2 孵育 2~3h，利于最大限度貼壁； 〔 4〕未貼壁的細(xì)胞離心，重新獲得細(xì)胞懸浮液，記數(shù)； 〔 5〕用多聚賴氨酸液預(yù)先包被培養(yǎng)皿〔 37℃ 〕 24h，每皿 接種 106個(gè)懸浮細(xì)胞； 〔 6〕 CO2 培養(yǎng)箱孵育 2h，換無血清化學(xué)限制培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)， 4天后換液。 第八十六頁，共一百一十二頁。 神經(jīng)組織 的體外培養(yǎng) 結(jié)果： 用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證 實(shí)，大約 98%的細(xì)胞是神經(jīng)元性質(zhì)的細(xì)胞。 因材料來源于胚胎組織，所以培養(yǎng)物中還有少量的 神經(jīng)前體細(xì)胞。 硼酸鹽緩沖液配制的 多聚賴氨酸生長基質(zhì)，其效果好于 蒸餾水。 第八十七頁，共一百一十二頁。 器官培養(yǎng) 概述： 器官培養(yǎng)：主要采用類似于組織培養(yǎng)中植塊培養(yǎng)的方式 培養(yǎng)器官型植塊。 根本技術(shù)特點(diǎn)：取出動(dòng)物器官或進(jìn)一步修整成器官型植 塊，將其接種到培養(yǎng)基上或培養(yǎng)液中，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)、氣相、 生長基質(zhì)等條件下，使其存活和生長。 開展歷史：最早 Leob〔 1897年〕進(jìn)行成年兔一些器官的 嘗試性培養(yǎng) —— 血漿凝快培養(yǎng)兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等 〔 3天〕； 20世紀(jì)初器官培養(yǎng)進(jìn)入活潑時(shí)期〔主要限于胚胎器 官〕； 20世紀(jì) 50年代進(jìn)入蓬勃開展階段〔不限于胚胎器官〕， 技術(shù)、器皿、培養(yǎng)基等有了許多改進(jìn)和革新。 第八十八頁，共一百一十二頁。 .1 器官培養(yǎng) 概述 迄今，文獻(xiàn)報(bào)道已在培養(yǎng)的人體器官：乳腺、眼、 內(nèi)耳、肝、腦、角膜、腎、肺、骨、皮膚、子宮、胸 腺、腸、牙、氣管、副甲狀腺、心臟、食管等等。 現(xiàn)代器官培養(yǎng)的共同點(diǎn)： 〔 1〕培養(yǎng)對象：非胚胎和胚胎器官的一局部； 〔 2〕浸泡在培養(yǎng)液中培養(yǎng)； 〔 3〕被培養(yǎng)組織器官的細(xì)胞以簡單擴(kuò)散方式獲得氧 氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)、排除 CO2和其他代謝廢物。