【正文】 SCM的原理 激光掃描共聚焦顯微術(shù)(LSCM)是80年代由于激光共聚焦顯微成像的產(chǎn)生而出現(xiàn)的集多種高、精、 尖細(xì)胞分析及工程技術(shù)于一體的新技術(shù)，是當(dāng)今世界上最先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器之一。LSCM 成像系統(tǒng)的基本工作原理是利用共聚焦光路和激光掃描獲得生物樣本的顯微斷層圖像，它是在熒光顯微 鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞 或組織內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的熒光圖像，其分辨率比以往光學(xué)成像的分辨率高出30％～40％，是光學(xué)顯微鏡發(fā) 展史上的重大突破。由于它的靈敏度高，能觀察空間結(jié)構(gòu)，從而對(duì)被檢物體由以往普通光鏡、電鏡的表面、 單層、靜態(tài)的觀察進(jìn)展到立體、斷層掃描、動(dòng)態(tài)全面的觀察，這獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng) 用。 二、已取得的研究成果 ：為把LSCM技術(shù)引入腦脊液細(xì)胞學(xué)研究領(lǐng)域，首要的問題是探索標(biāo)本制作方法。 為此，我組在實(shí)踐中大膽嘗試，將三種技術(shù)進(jìn)行有機(jī)組合，即用細(xì)胞收集器收集腦脊液細(xì)胞，丫叮橙(AO) 對(duì)腦脊液細(xì)胞進(jìn)行染色，用LSCM進(jìn)行斷層掃描，通過(guò)三維圖像重建顯示出腦脊液中淋巴細(xì)胞(大、中、 小)、激活淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、激活單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、腫瘤細(xì) 胞和白血病細(xì)胞等各類細(xì)胞的三維立體形態(tài)特征(胞核內(nèi)DNA呈亮綠色至黃綠色熒光，胞質(zhì)核核仁內(nèi) RNA呈桔紅色熒光)，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量進(jìn)行了定量測(cè)定。使我們對(duì)其立體分布及定量研究首 次超越了光鏡和電鏡的限制，使形態(tài)學(xué)觀察和定量研究有機(jī)結(jié)合，使不同細(xì)胞間DNA、RNA含量的細(xì)微 差別得以客觀評(píng)價(jià)。研究結(jié)果顯示，腦脊液中各種細(xì)胞的立體、動(dòng)態(tài)特征均有明顯差別，細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA的熒光強(qiáng)度地形強(qiáng)度立體圖也有明顯差別；腦脊液各種細(xì)胞間的DNA、RNA相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異有顯著性．其中腫瘤細(xì)胞和腦膜白血病細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA相對(duì)含量明顯高于正常對(duì)照組。結(jié)果對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病特別是腫瘤的診斷、治療、療程觀察、預(yù)后提供客觀指標(biāo)和依據(jù)。 2后續(xù)研究：為解決由于光鏡下腦脊液淋巴白血病細(xì)胞分辨率低、客觀性差，從而有可能造成腦膜白血病臨床診斷誤差的問題，研究人員將正常淋巴細(xì)胞與淋巴白血病細(xì)胞進(jìn)彳亍相同條件的A()熒光染色后，以LSCM進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)行了光學(xué)切片和三維重組后沿Z軸旋轉(zhuǎn)觀察，發(fā)現(xiàn)淋巴白血病細(xì)胞與正常淋巴細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)間有明顯差別。正常淋巴細(xì)胞較小，核圓形，呈綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)呈弱綠色熒光；而淋巴白血病細(xì)胞較大，核為卵圓形，呈桔黃色熒光，細(xì)胞質(zhì)呈火紅色熒光。細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA的熒光強(qiáng)度地形強(qiáng)度立體圖也有明顯差別，其相對(duì)含量也有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差異。 研究進(jìn)一步對(duì)鞘內(nèi)藥物注射治療一周的急性淋巴細(xì)胞性腦膜白血病細(xì)胞與治療前進(jìn)行比較，結(jié)果顯不，治療前后細(xì)胞形態(tài)有明顯改變治療前細(xì)胞核完整，無(wú)缺損破壞，治療后核畸形、斷裂、缺損。治療后細(xì)胞周長(zhǎng)和面積縮小，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度均明顯減低，細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA相對(duì)含量有顯著性差別。結(jié)果可為中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性淋巴細(xì)胞性白血病的臨床治療、療效判斷、預(yù)后及化療藥物的篩選提供可靠的指標(biāo)。 三、目前的研究 首次將I．SCM應(yīng)用于腦脊液急性淋巴白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究．使用高選擇性線粒體熒光探針Mitotracker Green FM和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針DioC6(3)進(jìn)行細(xì)胞器的標(biāo)記通過(guò)I。SCM技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，得到不同細(xì)胞細(xì)胞器的斷層掃描圖像、熒光強(qiáng)度地形立體分布圖，并且定量測(cè)量各組細(xì)胞的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光強(qiáng)度值。研究結(jié)果表明，正常淋巴細(xì)胞線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光弱，均勻分布于胞質(zhì)中，淋巴瘤及白血病細(xì)胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光較強(qiáng)，分布不均勻。各組細(xì)胞線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光強(qiáng)度地形立體分布圖亦顯示出各自不同的形態(tài)特點(diǎn)，正常淋巴細(xì)胞地形平坦。淋巴瘤細(xì)胞為不規(guī)則圓錐形。頂端參差不齊，鞘內(nèi)藥物注射治療后淋巴白血病細(xì)胞地形較治療前平坦，但與急性淋巴白血病細(xì)胞相比仍有區(qū)別。淋巴瘤細(xì)胞、鞘注前淋巴白血病細(xì)胞、鞘注后淋巴白血病細(xì)胞與正常淋巴細(xì)胞相比．線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平均熒光值大小順序?yàn)椋毫馨土黾?xì)胞鞘注前急性淋巴白血病細(xì)胞鞘注后急性淋巴白血病細(xì)胞正常淋巴細(xì)胞．各組間相比統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有非常顯著性差異。這對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的診斷、鑒別診斷、細(xì)胞分化程度和細(xì)胞功能狀態(tài)判斷、藥物療效評(píng)定有一定意義。 四、研究前景展望 已開展的研究向我們展示了I．SCM在腦脊液細(xì)胞學(xué)研究中的廣闊前景，LSCM結(jié)合眾多熒光探針的應(yīng)用，我們還可以對(duì)溶酶體、高爾基體、質(zhì)粒、細(xì)胞骨架等其他超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維動(dòng)態(tài)觀察并進(jìn)行定量分析，對(duì)于疾病的早期診斷、鑒別診斷、腫瘤細(xì)胞分化程度及功能狀態(tài)判斷、治療療效及預(yù)后判斷均有重要意義；通過(guò)識(shí)別腦脊液中死細(xì)胞或膜不完整的細(xì)胞。評(píng)價(jià)活細(xì)胞的功能，評(píng)價(jià)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)藥物、抗體等許多影響細(xì)胞完整性的細(xì)胞毒性作用，有可能在顱內(nèi)感染、腦膜白血病等諸多疾病的鑒別診斷、藥物療效觀測(cè)方面發(fā)揮重要作用；通過(guò)對(duì)腦寄生蟲病腦脊液細(xì)胞內(nèi)pH值的檢測(cè)有町能對(duì)于區(qū)分術(shù)同類型寄生蟲感染有重要意義；通過(guò)對(duì)腦脊液激活淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)Cａ２十離子動(dòng)態(tài)變化作毫秒級(jí)實(shí)時(shí)定量分析并且測(cè)定胞質(zhì)中ca２十對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、化學(xué)因子、生長(zhǎng)因子及各種激素等刺激的反應(yīng)，這對(duì)于了解相關(guān)疾病的細(xì)胞功能狀態(tài)及藥物療效、預(yù)后的判斷有重要意義；還可從超微結(jié)構(gòu)上觀察腦脊液細(xì)胞的凋亡，成為研究多種疾病腦脊液細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)及分子水平變化的有力工具；ＬSCM采用定量免疫熒光方法可以更加靈敏的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征、抗腫瘤藥物的作用機(jī)理及細(xì)胞內(nèi)分布進(jìn)行定量觀察和監(jiān)測(cè)。此項(xiàng)功能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的研究具有重要意義。記憶、情緒和注意的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)：認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)與前沿合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(230022) 汪凱 神經(jīng)心理學(xué)是研究高級(jí)認(rèn)知功能或心理活動(dòng)的神經(jīng)機(jī)制的一門學(xué)科，它從神經(jīng)學(xué)角度研究腦與心理活動(dòng)或認(rèn)知功能的關(guān)系。傳統(tǒng)上，它常常通過(guò)研究腦損傷患者的高級(jí)認(rèn)知功能缺損，來(lái)推斷正常狀態(tài)下該心理活動(dòng)或功能的腦機(jī)制。近來(lái)神經(jīng)心理學(xué)家已經(jīng)能利用各種(特別是腦功能成像，fMRI)技術(shù)研究損傷腦和正常腦在從事某～特定認(rèn)知加工時(shí)的實(shí)時(shí)腦區(qū)激活，為了解腦結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系提供一個(gè)更為直接的窗口。在半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展過(guò)程中，神經(jīng)心理學(xué)的發(fā)展經(jīng)歷了從臨床神經(jīng)心理學(xué)，到實(shí)驗(yàn)神經(jīng)心理學(xué)，再到認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)發(fā)展的過(guò)程。 認(rèn)知心理學(xué)是以信息加工觀點(diǎn)來(lái)研究認(rèn)知活動(dòng)(包括語(yǔ)言、記憶、思維等)的一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的科學(xué)，它常常建立由不同認(rèn)知元件的組成的認(rèn)知加工模型。它與神經(jīng)科學(xué)結(jié)合形成了認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)，而認(rèn)知心理學(xué)與神經(jīng)病學(xué)結(jié)合成為認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)，它已經(jīng)成為神經(jīng)心理學(xué)的重要發(fā)展方向，也是當(dāng)今“腦科學(xué)時(shí)代”的最為活躍的學(xué)科之一。我國(guó)開展認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)研究面臨著一個(gè)重要的發(fā)展機(jī)遇。 認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)(Cognitive Neuropsychology)以認(rèn)知能力異常的患者為研究對(duì)象，通過(guò)他們特異性損傷和保留的認(rèn)知結(jié)構(gòu)和功能來(lái)推知人類正常的認(rèn)知加工方式和神經(jīng)基礎(chǔ)的學(xué)科。因利用腦損傷患者從事實(shí)驗(yàn)的認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)研究，故又被稱之為基于腦損傷患者的認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)(PatienthａｓｅｄCognitive Neuroscience)。 認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)研究目的和意義主要在于考察和發(fā)展正常人的認(rèn)知心理學(xué)理論和模型、以及建立認(rèn)知神經(jīng)生物學(xué)模型，在臨床上也能為對(duì)病癥的診斷和康復(fù)治療提供心理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)的幾個(gè)基本假設(shè)包括：功能的／解剖的模塊化、個(gè)體間結(jié)構(gòu)和功能無(wú)差異性以及功能的遞減性?；镜难芯糠椒ㄊ菍ふ也煌J(rèn)知功能之間的分離(Dissociation)，包括單項(xiàng)分離和雙向分離，而后者則是建立認(rèn)知神經(jīng)生物學(xué)模型最為重要的依據(jù)。 一、記憶的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué) 認(rèn)知心理學(xué)將記憶加工過(guò)程分為編碼、貯存和提取三個(gè)過(guò)程，并提出了一些有關(guān)記憶認(rèn)知模型：At—kinson and Shiffrin的記憶模型、Baddeley的工作記憶模型以及記憶的多系統(tǒng)觀點(diǎn)。 在心理學(xué)模型和神經(jīng)心理學(xué)研究證據(jù)(Milner，1964)的基礎(chǔ)之上，Alvarez＆．Squire(1995)提出了有關(guān)記憶的內(nèi)側(cè)顳葉(Medial Temporal Lobe Memory System，MTI。)神經(jīng)生物學(xué)模型：認(rèn)為MTI，是信息加工的臨時(shí)貯存點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)初級(jí)、次級(jí)皮質(zhì)逐級(jí)加工信息的編碼，然后投射到新皮質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)貯存信息，形成長(zhǎng)時(shí)記憶。后來(lái)認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海馬損害患者的不但有長(zhǎng)時(shí)記憶的損害，而且這種長(zhǎng)時(shí)記憶損害呈現(xiàn)反向時(shí)間遞度性(temporal retrograde)，也就是說(shuō)越久遠(yuǎn)的記憶保存越好，而越近的記憶損傷越明顯，在這種認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)證據(jù)下，提出了海馬復(fù)合體多重痕跡的記憶模型(MultipleK—trace Model ofMemory，Nadel ＆ Moscovitch，1997)，即海馬不但參與記憶信息的初始編碼，也參與了以后不斷發(fā)生的記憶回放過(guò)程，并留下與新皮質(zhì)聯(lián)系痕跡，回放取次數(shù)越多留下的痕跡就越深，越不容易損傷。 除了顳葉以外，最近大量的研究表明額葉參與記憶的編碼的各個(gè)過(guò)程，例如記憶編碼提取得監(jiān)控．以及對(duì)記憶對(duì)象相關(guān)的背景信息(eontex)的記憶(source memory)。Tulving(1996)基于西方文字腦功能成像的研究結(jié)果．提出了額葉參與信息編碼和提取的不對(duì)稱性模型(Hemispheric encoding／retrieving a—symmetry，HERA)，其主要的觀點(diǎn)是左前額葉主要參與語(yǔ)義信息(語(yǔ)義記憶)的提取和新信息(情景記憶)的編碼，而右前額葉主要參與情景記憶的提取。但HERA模型還需要認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)的證據(jù)支持。而是否符合HERA模型有待進(jìn)一步的研究，我們最近完成的腦功能成像(fMRI)研究說(shuō)明額葉顯著參與了圖畫以及中文信息加工過(guò)程，并呈現(xiàn)出兩半球的不對(duì)稱性，但與HERA模型不盡相同。 二、情緒加工的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué) 情緒(如恐懼)在人類的進(jìn)化中起著重要的作用，情緒認(rèn)知及其神經(jīng)機(jī)制已引起認(rèn)知科學(xué)界的廣泛關(guān)注(Adolphs．1999)。Ekman(1982)認(rèn)為只有少數(shù)情緒是基本的，具有顯著性生物進(jìn)化意義和跨文化的一致性，基本情緒包括喜(happiness)、驚(surprise)、怕(fear)、悲(sadness)、厭(disgust)和怒(anger)等。情緒的傳統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)模型認(rèn)為，Papez環(huán)路或邊緣系統(tǒng)是各種情緒加工處理的中樞所在。最近有人提出額葉紋狀體皮質(zhì)環(huán)路也負(fù)責(zé)情緒處理。 最近10年，隨著定量化的情緒面孑L研究方法的建立和對(duì)意識(shí)水平下信息加工的研究推進(jìn)了“情緒與腦”研究的復(fù)興(Calder，2001)。目前有關(guān)情緒加工的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)研究主要關(guān)注的是不同情緒是否存在特殊的腦機(jī)制或基礎(chǔ)，以及哪些腦結(jié)構(gòu)參與了這種情緒的特殊腦機(jī)制，這方面的研究才剛剛開始，并已成為神經(jīng)科學(xué)及認(rèn)知科學(xué)研究的最前沿。 Adolphs、Young、Calder等(1994，1997，1999)在《Nature))等著名雜志上發(fā)表了幾例有關(guān)雙側(cè)杏仁核損傷者表現(xiàn)有選擇性恐懼表情的判別障礙的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)研究．而Sprengelmeyer等(1996)的研究表明Huntington氏病患者塒厭惡(disgust)表情判別有障礙，與前者構(gòu)成的雙向分離(double dissocia—tion)，這就提出了不同情緒的特異性神經(jīng)機(jī)制假說(shuō)。即某些不同情緒加工可能存在不同的神經(jīng)基礎(chǔ)，例如雙側(cè)杏仁核選擇性參與恐懼情緒加工，而基底節(jié)選擇性參與厭惡加工。這種假說(shuō)一方面是可能導(dǎo)致對(duì)傳統(tǒng)的情緒認(rèn)知神經(jīng)生物學(xué)模型的修改，但另外一方面需要更多的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)證據(jù)的支持。 我們最近發(fā)表的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)研究(Wang et al，2000，2001，2002，2003)顯示，單側(cè)杏仁核和雙側(cè)扣帶回?fù)p傷也可導(dǎo)致選擇性恐懼加工障礙，Wilson病患者則厭惡辨別障礙明顯，而右顳一頂葉或額葉損傷則導(dǎo)致各種情緒加工的普遍障礙。這些認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué)證據(jù)，如能結(jié)合腦功能成像研究的結(jié)果，將對(duì)理解情緒認(rèn)知加工的神經(jīng)機(jī)制有著十分重要的意義。 三、注意的認(rèn)知神經(jīng)心理學(xué) 注意是心理活動(dòng)或意識(shí)對(duì)一定信息和對(duì)象的指向和集中的過(guò)程，也是大腦對(duì)相關(guān)的感覺刺激加工的資源進(jìn)行適當(dāng)分配的過(guò)程。隨著認(rèn)知心理學(xué)的興起，注意的研究得到廣泛的重視，并已成為認(rèn)知心理學(xué)研究的一個(gè)重要的領(lǐng)域。注意的基本特征有集中性和選擇性，它包括4個(gè)亞成分：注意定向，選擇注意分散注意和維持注意。 注意的認(rèn)知模型：知覺選擇模型如過(guò)濾模型和衰減模型，反應(yīng)選擇模型和中樞能量理論假說(shuō)；80年代初期，Treisman提出了注意和知覺加工的內(nèi)部過(guò)程緊密地結(jié)合起來(lái)的特征整合模型；注意網(wǎng)絡(luò)及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制：Posner等在總結(jié)腦功能成像研究和動(dòng)物的腦損傷神經(jīng)心理學(xué)研究結(jié)果后，認(rèn)為注意作為一個(gè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，涉及到廣泛的腦結(jié)構(gòu)。Posner等(1990)提出注意網(wǎng)絡(luò)可分為警覺(Alerting)、定向(()rien—ting)與執(zhí)行控制(Executive Contr01)3個(gè)部分，(1)警覺是指維持一個(gè)警覺狀態(tài)；(2)定向是指從傳人的感覺中選擇信息；(3)執(zhí)行控制是指解決反應(yīng)中的沖突，并且在解剖和功能上都有獨(dú)自網(wǎng)絡(luò)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中涉及注意網(wǎng)絡(luò)的藥理學(xué)研究也支持注意網(wǎng)絡(luò)的三個(gè)部分有各自的神經(jīng)生化機(jī)制。警覺被認(rèn)為與腦內(nèi)的去甲腎上腺素系統(tǒng)有關(guān)，對(duì)抗去甲腎上腺素的藥物“可樂定”可減少或消除警覺信號(hào)對(duì)反應(yīng)時(shí)的影響，但不影響對(duì)靶子的定向作用。膽堿系統(tǒng)對(duì)注意