【正文】 (3)其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primer extension)制備單鏈DNA探針等。5．答： 主要差別是：CIP68176。C時失活，而BAP68176。C穩(wěn)定，且耐酚抽提。應用： (1)dsDNA的539。端脫磷酸，防止DNA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去后，再進行連接反應。 (2)DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進行末端標記。6．答： 外切核酸酶是從 噬菌體感染的E．coli中分離純化的，能夠從雙鏈DNA上依次切下539。單核苷酸，作用底物是雙鏈DNA的539。磷酸末端，不能切割羥基化539。端。該酶雖然能切割單鏈DNA,但效率較低(下降200倍)。不能切割帶切口或缺口的dsDNA。該酶作用時是行進性的，一步一步進行的。在基因工程中主要用于除去雙鏈DNA突出的539。末端，以便讓末端轉移酶加尾。7．答： DNase I是一種內(nèi)切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I隨機切割DNA兩條鏈中的任意一條鏈；當Mn2+代替Mg2+時，DNase I幾乎是在雙鏈DNA兩條鏈相對的位置上打開缺口，使雙鏈DNA斷裂，產(chǎn)生的末端幾乎是平末端或只突出1～2個核苷酸的DNA片段。 DNase I有許多用途：(1)在切口移位標記中，制造切口；(2)在足跡法中保護DNA； (3)除去RNA制備物中的DNA；(4)體外轉錄中除去DNA模板；(5)檢測染色體中的轉錄活性區(qū)；(6)產(chǎn)生可在噬菌體M13載體上進行測序的隨機克隆。8．答： 質(zhì)粒通過以下幾種機制維持在細胞中的穩(wěn)定： (1)多聚體質(zhì)粒的分解 如果質(zhì)粒在復制時形成多聚體的話，在細胞分裂過程中質(zhì)粒丟失的可能性就會增加。一個多聚體是由多個單體相互連接而成的。多聚體的形成可能是由于在復制終止時發(fā)生錯誤或者是由于單體間重組的結果。由于多聚體在細胞分裂時將作為一個質(zhì)粒進入一個子細胞，這樣，多聚體的形成就大大降低了質(zhì)粒的有效拷貝數(shù)，因此，多聚體也就大大增加了細胞分裂時質(zhì)粒丟失的機會。為了避免這種情況的發(fā)生，很多質(zhì)粒都具有位點專一性重組的系統(tǒng)，可以破壞多聚體。 (2)分離(partitioning) 質(zhì)粒通過一種分離系統(tǒng)來防止在細胞分裂過程中質(zhì)粒的丟失，這種機制保證在細胞分裂過程中每個子細胞至少可得到一個質(zhì)粒拷貝，這是由稱為par功能(Par functions)完成的。 所謂par功能是指某些質(zhì)粒，包括F、R1等質(zhì)粒上具有的一些短的區(qū)域，這些區(qū)域能夠增強質(zhì)粒拷貝的合適分配。如果從質(zhì)粒中將這種區(qū)域拿掉，質(zhì)粒丟失的頻率就會相當高。已經(jīng)深入研究過P1質(zhì)粒的分離系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)P1質(zhì)粒的分離系統(tǒng)由一個順式激活par序列和兩個蛋白ParA和，ParB的基因構成，其中一個蛋白同par位點結合。 關于par位點是怎樣增強質(zhì)粒適當分離的機制有兩種模型，按照這兩種模型，細菌的膜具有真核生物有絲分裂紡錘體的功能，在細胞分裂之前將質(zhì)粒分開。par位點是質(zhì)粒同質(zhì)膜結合的區(qū)域，在細胞分裂時，由于膜的生長，質(zhì)粒的兩個拷貝就被拉到兩個子細胞中。這兩個模型對于細胞分裂時，質(zhì)粒同質(zhì)膜的結合是怎樣保證每個細胞至少得到一個質(zhì)粒的解釋是不同的。 模型．A：par位點同細菌質(zhì)膜的一個假定位點結合。在這個模型中，每一種質(zhì)粒都有它自己獨特的同質(zhì)膜結合的位點。當細胞生長時，位點也加倍，每一個質(zhì)粒拷貝結合一個位點。由于這些位點隨著細胞分裂而分開，每一個質(zhì)粒拷貝將分配到一個子細胞。這就保證了質(zhì)粒不會丟失。該模型要解決的問題是質(zhì)膜上必須有許多獨特的位點以供不同的質(zhì)?？截惤Y合，這似乎不太可能。 將模型A稍微改動一下，就可以滿足質(zhì)粒分離所需的位點。如果我們假定質(zhì)粒結合的位點不在質(zhì)膜而是在細菌的染色體上就可以了。染色體上有很多的位點，并且隨著DNA的復制而加倍，這些位點可供質(zhì)粒結合。剩下的唯一問題就是在質(zhì)膜上有同染色體結合的獨特位點，這樣，質(zhì)粒將隨著染色體的分離而分離。 模型B同模型A基本類似，在這個模型中，質(zhì)粒的兩個拷貝在同質(zhì)膜結合之前必須通過它們的par位點相互配對。然后這兩個質(zhì)粒在細胞分裂過程中隨著質(zhì)膜位點的分離而分離。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒常常具有增加質(zhì)粒適當分離的位點，但是這些區(qū)域并沒有相同的結構，并不以相同的機制起作用。例如，質(zhì)粒pSCl01的par區(qū)可以增加質(zhì)粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何幫助質(zhì)粒的適當分離是不清楚的?？赡苁窃鰪娏速|(zhì)粒分離后的迅速復制，防止了下次分裂時的丟失。 (3)質(zhì)粒溺愛(plasmid addiction) 即使質(zhì)粒具有分離功能，質(zhì)粒也會從增殖的細胞中丟失。在一類復仇的細胞中，質(zhì)粒能夠編碼一些殺死丟失了質(zhì)粒的細胞。像F質(zhì)粒、R1質(zhì)粒、以及P1噬菌體都有這種功能。這些質(zhì)粒編碼一些毒性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)一旦表達就會殺死細胞。根據(jù)質(zhì)粒的來源不同，毒性蛋白質(zhì)可通過各種方式殺死細胞。 例如，質(zhì)粒的毒性蛋白Ccd,通過改變DNA螺旋酶來殺死細胞，由于螺旋酶的改編，引起了雙螺旋DNA的斷裂。質(zhì)粒R1的殺手蛋白Hok,破壞細菌細胞質(zhì)膜的功能，引起細胞活力的喪失。為什么毒性蛋白僅僅是在細胞丟失了質(zhì)粒之后立即殺死細胞?當細胞含有這種質(zhì)粒時，沉溺系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或RNA可作為一種解毒藥，既能阻止毒蛋白的合成，又能同毒蛋白結合并阻止毒蛋白起作用。 然而，這些其他基因的產(chǎn)物要比毒性蛋白不穩(wěn)定得多，所以它們會很快失活。如果一個細胞丟失了質(zhì)粒，既沒有毒性蛋白也沒有解毒劑的合成。但是，由于解毒劑更不穩(wěn)定，當解毒劑失活后，毒性蛋白就可以起殺傷作用。這些系統(tǒng)使細胞對質(zhì)粒產(chǎn)生溺愛，并防止細胞丟失質(zhì)粒。9．答： (1)非傳遞性和不被帶動轉移。對于多數(shù)基因克隆操作來說，都不希望載體能夠進行自主傳遞，也不希望被帶動轉移。 (2)具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pJC307(ColEl的衍生質(zhì)粒)在哺乳動物正常體溫下就喪失復制能力，可防止克隆基因擴散，只存在于限定的宿主細胞中。(3)一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因為重組后有可能給宿主帶來突變。 (4)有較小的宿主范圍。10． 答： (1)菌體DNA沒有容載能力，因為噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將l噬菌體改造成載體，必須削減分子量。 (2)野生型的lDNA對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點，不便于克隆。 (3)沒有可供選擇的標記。 (4)野生型的l噬菌體具有感染性，因此不夠安全。11．答： 這種方法是根據(jù)組織化學的原理來篩選重組體。主要是在l載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌b—半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的l載體轉入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(Xgal)平板上形成淺藍色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解Xgal的能力，轉入lac宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷 (Xgal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍色噬菌斑。12．答： b—半乳糖苷酶的N末端是非必需的，可以進行修飾，并不影響酶的活性或a肽的互 補性。如果插入的外源DNA引起a肽的可讀框的改變，或者插入片段在正確的可讀框中含有終止密碼的話，就會形成白色噬菌斑。如果插入DNA的堿基數(shù)正好是3的倍數(shù)，或者插入的DNA中不含有終止密碼的話，仍然會形成藍色噬菌斑。這種插入物的長度可達幾百個堿基對。M13載體的這種性質(zhì)可以用來檢測和選擇產(chǎn)生新的終止密碼或改變可讀框，即移碼突變。13．答 M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點： (1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時不受體積的限制，所以容載能力大，有報道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長6—7倍的DNA(插人片段可達40kb)。 (2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對于DNA測序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。 (3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標記進行篩選。 M13克隆系列的不足： (1)較大的外源片段插入后，在擴增過程中往往不夠穩(wěn)定，一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的機率越大。 (2)單鏈載體分子感染的細胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。14．答： 主要特點有： (1)具有質(zhì)粒復制子，進入寄主細胞后能夠像質(zhì)粒一樣進行復制，并且能夠被氯霉素擴增。 (2)具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標記。 (3)具有l(wèi)噬菌體的包裝和轉導特性。 (4)容載能力大?？寺〉淖畲笃卧?5kb，最小片段為19kb。 (5)簡化了篩選。如果載體的分子量在5kb的話，得到的轉導子幾乎排除由載體自連的可能性，因為要被成功包裝，至少要7個分子的載體自連，盡管如此，也是不能被包裝的，因為COS位點太多了。 黏粒載體也有如下不足：(1)如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發(fā)生重組，結果會使被克隆的片段重排或丟失。 (2)含不同重組DNA片段的菌落生長速度不同，會造成同一個子板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段對宿主細胞的作用不同，會造成文庫擴增量的比例失調(diào)。 (3)包裝過程復雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價高。 15．答： 雖然噬菌粒載體攜帶有M13的IG區(qū)，能夠合成單鏈DNA，但是它沒有M13的功能基因，沒有M13基因2的產(chǎn)物存在，所以不能合成單鏈DNA。而輔助噬菌體具有M13的所有功能基因，但是IG區(qū)是缺陷的，輔助噬菌體本身的DNA不能進行單鏈復制，于是就可以為噬菌粒提供基因2產(chǎn)物和包裝蛋白。 輔助噬菌體必需具備如下條件： (1)助噬菌體的DNA IG區(qū)必需失去功能，其本身的DNA不會被包裝到成熟的噬菌體顆粒中； （2）由于輔助噬菌體的IG區(qū)失活，其本身的基因不能表達，要使輔助噬菌體的所有功能基因都能進行表達，必須在輔助噬菌體的基因組中導人新的復制起點； (3)輔助噬菌體的基因組中具有選擇標記，便于識別和收集一定數(shù)量的輔助噬菌體。16．答： 可以通過合成核苷酸探針或設計簡并PCR引物從cDNA文庫或基因組文庫中篩選?；蛘呃孟鄳目贵w從cDNA表達文庫中篩選相應的克隆。17．答： 基因文庫，或克隆文庫，是一群細菌克隆，每個克隆含有一個帶有某一供體生物不同DNA片段的質(zhì)?；蚴删w載體；這群克隆有95％99％的可能性使基因組DNA的每一片段至少存在于一個克隆中。一個基因文庫一旦建立，任一特定的克隆都可被回收用于研究其所攜帶的基因，因而在需要克隆某一特定基因時就避免了逐個巡查克隆的耗時過程。為減少所要收集的克隆的數(shù)目，最普遍采用的載體是l噬菌體的一種衍生載體，它可容納12~20kb的供體DNA片段，這點與pBR322不同，它可插入的外源DNA最大約為5kb．18．答： 基因組文庫是用基因工程的方法，人工構建的含有某一生物基因組DNA的各種片段 的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程：(1)高分子量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導人寄主細胞；(6)篩選?；蚪M文庫同遺傳學上所講的基因庫是完全不同的概念?；驇?gene pool)是指在進行有性生殖的某一群體中，能進行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。19．答： 同mRNA互補的DNA稱為cDNA。cDNA文庫是以某一生物的總mRNA為模板，在無細胞系統(tǒng)中，在反轉錄酶的作用下，首先合成一互補的DNA, 即第一鏈，破壞RNA模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到的雙鏈DNA稱為cDNA。選用適合的載體，將合成的cDNA重組導人寄主細胞，經(jīng)篩選得到韻cDNA克隆群稱為cDNA文庫。由于cDNA技術合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細胞內(nèi)的基因在表達的時間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時間性．有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNA文庫是不可能構建得十分全，也就是說任何一個cDNA文庫都不可能包含某—生物全部編碼基因。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是： (1)基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結構基因，包括調(diào)節(jié)基因； (2)基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響； (3)基因組文庫中的編碼基因是真實基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而eDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。20．答： 黏性末端連接法不足之處有：(1)載體易自身環(huán)化；(2)若是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克??；(3)難插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán)化，載體也有成環(huán)的傾向；(5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個外源片段或不止一個載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難。21．答： 所謂同聚物加尾法就是利用末端轉移酶在載體及外源雙鏈DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA連接酶的作用下漣接成為重組的DNA。這種方法的核心是利用末端轉移酶的功能，將核苷酸轉移到雙鏈DNA分子的突出或隱蔽的339。OH上。以Mg2+作為輔助因子，該酶可以在突出的339。OH端逐個添加單核苷酸，如果用Co2+作輔助因子則可在隱蔽的或平末端的339。OH端逐個添加單個核苷酸。 同聚物加尾法實際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點：．(1)首先不易自身環(huán)化，這是因為同一種DNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。(2)因為載體和外源片段的末端是互補的黏