【正文】 e of SGC7901 cells in the presence or absence of several proapoptotic agents and inhibit the cells growth, which indicate that the interference with livin leads to a sensitization to proapoptotic stimuli. The similar result on hela cell was reported by CrnkovicMertens [18].In summary, our results showed that inhibition of livin expression and function resulted in spontaneous apoptosis and inhibitor cell growth enhanced sensitivity to cytotoxic drugs in vitro. Because of the preferential expression of livin in gastric cancer but not in normal tissues, these data suggest that targeting the livin pathway alone or with cytotoxic drugs may be useful in the treatment of gastric cancer. Despite their therapeutic potential, major technical hurdles still have to be overe, in order to apply shRNAs as drugs. Under therapeutic aspects, will have to meet the general challenges of gene therapy approaches, such as efficient delivery into the target cells or the circumvention of immune responses. Notably, recent in vivo studies showed that shRNAs could be directly applied to organs of postnatal mice by highpressure injection into the tail vein, leading to the specific inhibition of target genes [2830]. These data show that a direct application of active shRNAs via the bloodstream is principally feasible.　英文翻譯學(xué) 生 姓 名 徐蔓玲 指 導(dǎo) 教 師 王寶慶 專 業(yè) 制藥工程 學(xué) 院 藥學(xué)院 2011年 5 月 25 日 介導(dǎo)的shRNA能抑制肺癌細(xì)胞中l(wèi)ivin沉默基因的表達(dá)從而促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡背景—由于腫瘤細(xì)胞抑制凋亡增殖,特定凋亡的抑制因素會(huì)對(duì)于發(fā)展新的治療策略提供一個(gè)合理途徑。但是, 在有關(guān)胃癌方面沒有可利用的數(shù)據(jù)。方法—mRNA及蛋白質(zhì)livin基因的表達(dá)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及西方吸干化驗(yàn)進(jìn)行了分析。然后用Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染進(jìn)入SGC7901細(xì)胞。所得到的穩(wěn)定的復(fù)制品用G418來篩選。細(xì)胞生長狀態(tài)和5FU的50%抑制濃度(IC50)和順鉑都由MTT比色法來決定。沒有l(wèi)ivin基因表達(dá)的是在腫瘤鄰近組織和良性胃潰瘍病灶。 )。其中之一,能有效地減少livin基因的表達(dá),抑制基因不少于70%(P重組的質(zhì)粒被提取和轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞。當(dāng)livin基因沉默,胃癌細(xì)胞的生殖活動(dòng)明顯低于對(duì)照組(P研究還表明,IC50上的5Fu和順鉑在胃癌細(xì)胞的治療上是通過shRNA減少以及刺激這些細(xì)胞(5Fu proapoptotic和順鉑)(P結(jié)論—livin基因在胃癌中的過分表達(dá)與腫瘤分化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移建立聯(lián)系,建議了治療胃癌病例分子預(yù)后因素之一。Livin可以作為治療胃癌凋亡的新目標(biāo)。大多數(shù)患者被診斷為這個(gè)疾病的階段,在最佳時(shí)間的機(jī)會(huì)錯(cuò)失了手術(shù)治愈。癌癥細(xì)胞化療耐抗性可能導(dǎo)致手術(shù)失敗。癌細(xì)胞常有抗凋亡增長的特征[1],介導(dǎo)其增加的阻力不同來刺激的細(xì)胞凋亡,如DNA損傷、缺氧、營養(yǎng)損失[3]。酶抑制劑 (IAPs),是一種新型的凋亡蛋白抑制基因家族[5,6],包括病毒感染,化療藥物, ,生長因子和腫瘤壞死因子α(TNFα凋亡信號(hào)通路)/ Fas信號(hào)通路[7 9]。這個(gè)家庭的新成員是MLIAP/livin/KIAP/BIRC7 (以下稱為livin)有兩個(gè)種類、livinα和livinβ[1114]。有趣的是, livin基因被發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中限制性表達(dá),但是不存在或是很少數(shù)量存在于正常成人體組織中[1115],并且通過允許惡性細(xì)胞,以避免凋亡細(xì)胞死亡的方式導(dǎo)致腫瘤形成,。在目前的研究中,我們調(diào)查了livin的表達(dá)在胃cancinomas及其鄰近組織。此外,我們探索了在抑制livin基因表達(dá)的shRNA可行性和胃癌易感性的凋亡細(xì)胞由shRNA介導(dǎo)的 livin沉默基因?；颊吆湍[瘤樣本胃癌中四十個(gè)病例及接受胃切除手術(shù)的患者收集到的胃癌組織中13個(gè)病例(患者年齡從29~77歲)。這些病例均來自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。手術(shù)之后腫瘤標(biāo)本就立即被凍結(jié)在液態(tài)氮中,儲(chǔ)存在80℃直到使用為止?？偣睷NA(2毫克)提取冷凍組織反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，最后的體積2微升是用100 pmol of oligo(dT)15和200U MMLV與逆轉(zhuǎn)錄酶(promega、美國) ,根據(jù)制造商的說明。每一個(gè)放大了35周期,一個(gè)周期的變性曲線在30 s內(nèi)到達(dá)94℃。沒有RNA的病例作為陰性對(duì)照物包含在RT–PCR中。livinα/ βdownstream。βactin upstream,5＇ACGGCACAAAGACGATGGAC3＇βactin downstream,5＇AGCGCAAGTACTCCGTGTG3＇。 西方吸干技術(shù)分析病變同質(zhì)性與沖力緩沖50mM TrisHCl (pH ), 250 mM NaCl,% NP40和5mM EGTA包含50mM氟化鈉，60mM β丙三醇磷酸鹽,。蛋白質(zhì)樣品電泳10% 變性SDS凝膠并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Roche、美國)。Alexesis(美國) 和散塔克魯茲生物技術(shù)(美國)購買的單克隆抗體livin (1:250) and actin (1:400)24細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)我們選了一個(gè)人類胃腺癌細(xì)胞系在這一研究中。線是胃癌細(xì)胞上皮細(xì)胞,并成長為附著細(xì)胞RPMI 1640 (Hyclone Inc, USA)含10%FCS (Life Technologies, Inc.),每毫升100個(gè)單位的青霉素和毫升100微克的鏈霉素(BioWhittaker)。溶解順鉑和氟尿嘧啶(齊魯制藥廠、中國)在DMSO并且4℃儲(chǔ)存。ShRNA的合成和PGPU / GFP /Neo/livin質(zhì)粒的制造通過siRNASequenceSelector軟件設(shè)計(jì)并合成了Livin的ShRNA序列(上海生物技術(shù)有限責(zé)任公司。序列如下(表1),然后被插入pGPU/GFP/Neo(上海GenePharma股份有限公司。,SGC7901細(xì)胞被鍍成6孔板(3105孔密度), , 96孔板(1 104孔密度)和12孔板( 105孔密度)轉(zhuǎn)染之前培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)移在 1:15 (v/v)并用Geneticin (G418) 1000克/毫升培養(yǎng)4周。2．7依賴貼壁細(xì)胞細(xì)胞生長的測定親本細(xì)胞和細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)pGPU/GFP/Neo/vector, pGPU/GFP/Neo/livin or pGPU/GFP/Neo/Control被種到6孔盤子中。使用計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)目(Coulter Electronics, Miami, FL).。通過MTT對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行了測量。接下來這些細(xì)胞被以不同濃度的藥物治療48小時(shí)。上層清液用異丙醇代替溶解有色甲品。治療細(xì)胞的吸光率相當(dāng)于計(jì)算控制細(xì)胞的吸光率并用細(xì)胞死亡百分率顯示出來。懸浮后后，100 ml核糖核酸酶I (1 mg/ml) and 100 ml 的聚酰亞胺(400 μg/ml) 37℃下培養(yǎng)細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)(BD,美國)進(jìn)行分析。SD的方法。 。livin在胃腸癌中的表達(dá)在目前的研究中,我們第一次驗(yàn)證了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和西方吸干技術(shù)的存在在40胃癌中,13 癌組織和13良性病變胃粘膜損傷。livin表達(dá)與預(yù)后變量相關(guān),如組織學(xué)惡性度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但包括年齡、性別、階段和腫瘤細(xì)胞浸潤程度(表2)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)pGPU/GFP/Neo/livin與pGPU/GFP/Neo/Control的特征我們建立了SGC7901 與任一pGPU/GFP/Neo/livin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，pGPU/GFP/Neo /Control 質(zhì)粒，或空pGPU/GFP/Neo/vector (圖3)。其他的都被選擇作為擴(kuò)展和另外的研究。Livin表達(dá)抑制在pGPU/GFP/Neo/livin1轉(zhuǎn)染和消極控制中沒有被發(fā)現(xiàn)。SGC7901的增長率pGPU / GFP /Neo/ livin2均有顯著的抑制轉(zhuǎn)染。 ),而陰性對(duì)照和家長的細(xì)胞。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染容易受細(xì)胞凋亡因子刺激我們認(rèn)為SGC7901 pGPU/GFP/Neo/livin2 轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照細(xì)胞同細(xì)胞毒順鉑的增長速率明顯抑制，圖表6中顯示SGC7901 pGPU/GFP/Neo/livin2轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)后72小時(shí)和96小時(shí)與消極控制和親本細(xì)胞相比明顯降低陰性對(duì)照細(xì)胞和細(xì)胞毒藥物(5 氟尿嘧啶和順鉑)。 3倍的pGPU/GFP/Neo/livin2轉(zhuǎn)相比，其控制細(xì)胞（P。）。圖7C條）凋亡刺激。據(jù)認(rèn)為，活著有兩個(gè)亞型，A和B雖然這兩個(gè)亞型在阻止腫瘤壞死因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與 A和抗CD95的在體外，他們表現(xiàn)出一些不同的抗凋亡的特性。一些組織中Livin分布研究表明，最近都活著升高亞型A和B已發(fā)現(xiàn)在心臟，胎盤，肺，脾，卵巢，而活著balone特別是在已檢測到胎兒組織和dult腎臟和Livin一單是在腦，骨骼肌和外周血淋巴細(xì)胞的檢測[1114]。我們的第一次研究表明，活著亞型A和B幾乎都在胃癌組織（％）和Livin表達(dá)與一些已知的預(yù)后因素，如分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，相關(guān)的比例計(jì)算。胃癌一般具有高度抗癌癥放化療和中抗凋亡[21]。與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗可能提供一個(gè)合理干預(yù)策略在癌癥治療的基礎(chǔ)上發(fā)展新的特定因素干擾[22,23]。的shRNA技術(shù)representiong一個(gè)極其有力的工具，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)[24,25]作出抑制Livin基因，并試圖糾正胃癌細(xì)胞凋亡的不足。在這項(xiàng)研究中，我們觀察到硅livin1是經(jīng)常更強(qiáng)烈的沉默比硅livin2 Livin基因。對(duì)HeLa細(xì)胞類似的結(jié)果報(bào)告了Crnkovic 梅坦斯[18]。由于在胃癌中的表達(dá)，但活著的優(yōu)惠在正常組織中，這些數(shù)據(jù)表明，針對(duì)活著途徑單獨(dú)或與細(xì)胞毒性藥物可能在胃癌的治療作用。在治療方面，將不得不滿足基因治療的辦法，如高效輸送到目標(biāo)細(xì)胞的免疫反應(yīng)或規(guī)避，一般的挑戰(zhàn)。這些數(shù)據(jù)表明，一個(gè)活躍的shRNA通過血液的直接應(yīng)用是主