【正文】 細(xì)胞凋亡[12]。有趣的是, livin基因被發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中限制性表達(dá),但是不存在或是很少數(shù)量存在于正常成人體組織中[1115],并且通過(guò)允許惡性細(xì)胞,以避免凋亡細(xì)胞死亡的方式導(dǎo)致腫瘤形成,。所以抑制livin基因表達(dá)可能會(huì)呈現(xiàn)出一個(gè)有趣的治療策略。在目前的研究中,我們調(diào)查了livin的表達(dá)在胃cancinomas及其鄰近組織。livin的表達(dá)和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。此外,我們探索了在抑制livin基因表達(dá)的shRNA可行性和胃癌易感性的凋亡細(xì)胞由shRNA介導(dǎo)的 livin沉默基因。2患者和方法?；颊吆湍[瘤樣本胃癌中四十個(gè)病例及接受胃切除手術(shù)的患者收集到的胃癌組織中13個(gè)病例(患者年齡從29~77歲)。其中良性胃潰瘍的13個(gè)病例(慢性淺表胃炎)患者在接受了胃內(nèi)視鏡檢查(患者年齡從33~77歲)。這些病例均來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。胃癌患者被診斷為TNM級(jí)的1~4階段(UICC ，2002)。手術(shù)之后腫瘤標(biāo)本就立即被凍結(jié)在液態(tài)氮中,儲(chǔ)存在80℃直到使用為止。這是在所有的病人知情同意的情況下獲得的?？偣睷NA(2毫克)提取冷凍組織反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，最后的體積2微升是用100 pmol of oligo(dT)15和200U MMLV與逆轉(zhuǎn)錄酶(promega、美國(guó)) ,根據(jù)制造商的說(shuō)明。Aliquots對(duì)應(yīng)的250微升cDNA被放大在PCR緩沖容器中，在最終的50微升中含25pmol / ml處理劑和1U聚合酶。每一個(gè)放大了35周期,一個(gè)周期的變性曲線在30 s內(nèi)到達(dá)94℃。熱處理在30s內(nèi)59℃（livin and bactin）擴(kuò)大到30s內(nèi)72℃。沒(méi)有RNA的病例作為陰性對(duì)照物包含在RT–PCR中。一系列常用的的 livin和βactin處理劑如下： livinα / βupstream，5＇TCCACAGTGTGCAGGAGACT3＇。livinα/ βdownstream。5＇TCCACAGTGTGCAGGAGACT3＇。βactin upstream,5＇ACGGCACAAAGACGATGGAC3＇βactin downstream,5＇AGCGCAAGTACTCCGTGTG3＇。產(chǎn)品的尺寸分別為livinα/β是312/258 bp ，βactin 是501bp。 西方吸干技術(shù)分析病變同質(zhì)性與沖力緩沖50mM TrisHCl (pH ), 250 mM NaCl,% NP40和5mM EGTA包含50mM氟化鈉，60mM β丙三醇磷酸鹽,。用考馬斯亮藍(lán)微盤比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)樣品電泳10% 變性SDS凝膠并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Roche、美國(guó))。膜是培養(yǎng)特定的主要的抗體,與過(guò)氧化物酶繼發(fā)性抗體反應(yīng) (細(xì)胞信號(hào)技術(shù)、美國(guó)),最后通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)熒光達(dá)到可視化 (細(xì)胞信號(hào)技術(shù)、美國(guó))。Alexesis(美國(guó)) 和散塔克魯茲生物技術(shù)(美國(guó))購(gòu)買的單克隆抗體livin (1:250) and actin (1:400)24細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)我們選了一個(gè)人類胃腺癌細(xì)胞系在這一研究中。SGC7901(上海細(xì)胞研究所,中國(guó)上海,)是一種附著中度分化胃腺的人類細(xì)胞株。線是胃癌細(xì)胞上皮細(xì)胞,并成長(zhǎng)為附著細(xì)胞RPMI 1640 (Hyclone Inc, USA)含10%FCS (Life Technologies, Inc.),每毫升100個(gè)單位的青霉素和毫升100微克的鏈霉素(BioWhittaker)。在含有5%CO2空氣的條件下的37℃濕潤(rùn)培養(yǎng)器中保存SGC7901細(xì)胞。溶解順鉑和氟尿嘧啶(齊魯制藥廠、中國(guó))在DMSO并且4℃儲(chǔ)存。ShRNA的合成和PGPU / GFP /Neo/livin質(zhì)粒的制造通過(guò)siRNASequenceSelector軟件設(shè)計(jì)并合成了Livin的ShRNA序列(上海生物技術(shù)有限責(zé)任公司。集團(tuán)公司、中國(guó))。序列如下(表1),然后被插入pGPU/GFP/Neo(上海GenePharma股份有限公司。中國(guó)) BbsI and BamH地址產(chǎn)生pGPU/GFP/Neo/livin and pGPU/GFP/Neo/Control質(zhì)子。,SGC7901細(xì)胞被鍍成6孔板(3105孔密度), , 96孔板(1 104孔密度)和12孔板( 105孔密度)轉(zhuǎn)染之前培養(yǎng)24小時(shí)。按照制造商的說(shuō)明這些細(xì)胞被調(diào)控子用LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染4毫克/孔空的pGPU/GFP/Neo/vector， pGPU/GFP/Neo/livin或pGPU/GFP/Neo/Control 質(zhì)粒 (生命技術(shù)公司、大島嶼,NY)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,這些細(xì)胞被轉(zhuǎn)移在 1:15 (v/v)并用Geneticin (G418) 1000克/毫升培養(yǎng)4周。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆體取出并保存在媒介容器400 g/ml G418用作另外的研究。2．7依賴貼壁細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定親本細(xì)胞和細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)pGPU/GFP/Neo/vector, pGPU/GFP/Neo/livin or pGPU/GFP/Neo/Control被種到6孔盤子中。每隔一天收集三孔的細(xì)胞。使用計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)目(Coulter Electronics, Miami, FL).。種植一些天數(shù)后用平均SD記錄每孔細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)MTT對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行了測(cè)量。呈幾何數(shù)增長(zhǎng)的細(xì)胞被鍍?cè)诿芏葹?0000細(xì)胞/孔的96孔板上作用24小時(shí)。接下來(lái)這些細(xì)胞被以不同濃度的藥物治療48小時(shí)。每孔加入100微升MTT溶液 (1毫克/毫升),并且這些細(xì)胞放在37℃下培養(yǎng)四小時(shí)。上層清液用異丙醇代替溶解有色甲品。用microELISA測(cè)量到吸光率的波長(zhǎng)為595nm(ClinBio128 SLT, ,奧地利)。治療細(xì)胞的吸光率相當(dāng)于計(jì)算控制細(xì)胞的吸光率并用細(xì)胞死亡百分率顯示出來(lái)。細(xì)胞被收集并加入冰冷的70%乙醇于PBS緩沖液中儲(chǔ)存在4攝℃暖直到使用。懸浮后后，100 ml核糖核酸酶I (1 mg/ml) and 100 ml 的聚酰亞胺(400 μg/ml) 37℃下培養(yǎng)細(xì)胞并用流式細(xì)胞術(shù)(BD,美國(guó))進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)的展現(xiàn)要用至少三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)177。SD的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用學(xué)生的t檢驗(yàn)來(lái)分析和當(dāng)P 。3結(jié)果。livin在胃腸癌中的表達(dá)在目前的研究中,我們第一次驗(yàn)證了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和西方吸干技術(shù)的存在在40胃癌中,13 癌組織和13良性病變胃粘膜損傷。在癌組織和良性病變胃粘膜損傷中, 每個(gè)mRNA亞型不可見(jiàn)水平被發(fā)現(xiàn)后,在腫瘤組織中,19/40(%)顯示出mRNA及l(fā)ivinaα和livinβ蛋白質(zhì)表達(dá)(Figs. 1 and 2). 。livin表達(dá)與預(yù)后變量相關(guān),如組織學(xué)惡性度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但包括年齡、性別、階段和腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度(表2)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)pGPU/GFP/Neo/livin與pGPU/GFP/Neo/Control的特征我們建立了SGC7901 與任一pGPU/GFP/Neo/livin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，pGPU/GFP/Neo /Control 質(zhì)粒，或空pGPU/GFP/Neo/vector (圖3)。用西方吸干技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)選擇每個(gè)轉(zhuǎn)染的克隆并分析決定livin mRNA,和蛋白質(zhì)表達(dá)。其他的都被選擇作為擴(kuò)展和另外的研究。(如圖4及5)顯示， livin mRNA和蛋白質(zhì)的水平在SGC7901pGPU/GFP/Neo/livin2中轉(zhuǎn)染降低了90%以上。Livin表達(dá)抑制在pGPU/GFP/Neo/livin1轉(zhuǎn)染和消極控制中沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。所以SGC7901 pGPU/GFP/Neo/livin2被用來(lái)做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SGC7901的增長(zhǎng)率pGPU / GFP /Neo/ livin2均有顯著的抑制轉(zhuǎn)染。如圖顯示，SGC7901 Pgpu/GFP/尼歐/ livin2 / GFP細(xì)胞數(shù)目有顯著下降轉(zhuǎn)染在72小時(shí)到96小時(shí)后鍍(P ),而陰性對(duì)照和家長(zhǎng)的細(xì)胞。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染容易受細(xì)胞凋亡因子刺激我們認(rèn)為SGC7901 pGPU/GFP/Neo/livin2 轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照細(xì)胞同細(xì)胞毒順鉑的增長(zhǎng)速率明顯抑制，圖表6中顯示SGC7901 pGPU/GFP/Neo/livin2轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量培養(yǎng)后72小時(shí)和96小時(shí)與消極控制和親本細(xì)胞相比明顯降低陰性對(duì)照細(xì)胞和細(xì)胞毒藥物(5 氟尿嘧啶和順鉑)。pGPU MTT測(cè)定表明,SGC7901 /Neo/ livin2 / GFP更敏感轉(zhuǎn)染順鉑和氟尿嘧啶比消極的控制和親本細(xì)胞(Figs. 7A, 6B)。 3倍的pGPU/GFP/Neo/livin2轉(zhuǎn)相比，其控制細(xì)胞（P。圖7C條。）。此外，經(jīng)歷了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染無(wú)自發(fā)性凋亡更容易比對(duì)照細(xì)胞（P。圖7C條）凋亡刺激。討論在本研究中,我們表明,推薦的新成員: 一個(gè)新的IAP家族成員，被認(rèn)為是不符合非癌胃組織的表達(dá)，只有在胃癌患者（％）的比例計(jì)算，也表明，抑制Livin的表達(dá)或功能的原因自發(fā)性細(xì)胞凋亡和對(duì)SGC 7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，使細(xì)胞更容易凋亡刺激。據(jù)認(rèn)為，活著有兩個(gè)亞型，A和B雖然這兩個(gè)亞型在阻止腫瘤壞死因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與 A和抗CD95的在體外，他們表現(xiàn)出一些不同的抗凋亡的特性。活著b似乎是在阻斷DNA損傷劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]超過(guò)活著有效。一些組織中Livin分布研究表明，最近都活著升高亞型A和B已發(fā)現(xiàn)在心臟，胎盤，肺，脾，卵巢，而活著balone特別是在已檢測(cè)到胎兒組織和dult腎臟和Livin一單是在腦，骨骼肌和外周血淋巴細(xì)胞的檢測(cè)[1114]。此外，雖然Livin的表達(dá)是在一個(gè)癌細(xì)胞的細(xì)胞株和腫瘤組織中的一些品種檢測(cè)[1418]和反活著抗體在胃癌和肺癌患者血清識(shí)別[19,20]，沒(méi)有數(shù)據(jù)有關(guān)亞型中Livin的表達(dá)在胃癌腫瘤組織。我們的第一次研究表明，活著亞型A和B幾乎都在胃癌組織（％）和Livin表達(dá)與一些已知的預(yù)后因素，如分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，相關(guān)的比例計(jì)算。從文獻(xiàn)資料表明，這兩個(gè)活著亞型參與了阻止細(xì)胞凋亡，并可能給活著的過(guò)度表達(dá)與細(xì)胞的強(qiáng)烈抵抗化療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。胃癌一般具有高度抗癌癥放化療和中抗凋亡[21]。這些結(jié)果表明，Livin的高表達(dá)可能對(duì)某些癌癥患者和胃癌患者預(yù)后化療的責(zé)任。與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗可能提供一個(gè)合理干預(yù)策略在癌癥治療的基礎(chǔ)上發(fā)展新的特定因素干擾[22,23]。由于Livin的表達(dá)可能有助于腫瘤細(xì)胞和腫瘤的特異性表達(dá)及其在細(xì)胞凋亡的抗性表型可以讓活著的一個(gè)有趣的腫瘤治療靶點(diǎn)的具體干預(yù)措施的戰(zhàn)略，我們選擇了作為一個(gè)分子靶點(diǎn)的Livin基因。的shRNA技術(shù)representiong一個(gè)極其有力的工具，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)[24,25]作出抑制Livin基因，并試圖糾正胃癌細(xì)胞凋亡的不足。作者：沉默的shRNA功效的tageted基因的表達(dá)是不同的，與半的生活和豐富的基因產(chǎn)物與靶mRNA作為[2427]，以及無(wú)障礙的關(guān)系。在這項(xiàng)研究中，我們觀察到硅livin1是經(jīng)常更強(qiáng)烈的沉默比硅livin2 Livin基因。我們的研究結(jié)果還表明，沉默Livin基因的表達(dá)可能存在強(qiáng)烈的增加或幾個(gè)凋亡的代理人在場(chǎng)下的SGC 7901細(xì)胞凋亡反應(yīng)，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，這表明，與美好生活的干擾導(dǎo)致了對(duì)凋亡刺激的敏感性。對(duì)HeLa細(xì)胞類似的結(jié)果報(bào)告了Crnkovic 梅坦斯[18]。總之，我們的結(jié)果表明，Livin的表達(dá)和功能抑制自發(fā)性細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的體外敏感性增強(qiáng)化療藥物的結(jié)果。由于在胃癌中的表達(dá)，但活著的優(yōu)惠在正常組織中，這些數(shù)據(jù)表明，針對(duì)活著途徑單獨(dú)或與細(xì)胞毒性藥物可能在胃癌的治療作用。盡管他們的治療潛力，主要技術(shù)障礙仍有待克服，才能申請(qǐng)成為毒品的shRNA。在治療方面，將不得不滿足基因治療的辦法，如高效輸送到目標(biāo)細(xì)胞的免疫反應(yīng)或規(guī)避，一般的挑戰(zhàn)。值得注意的是，在最近的研究表明，體內(nèi)的shRNA可以直接應(yīng)用到出生后小鼠臟器highpressure尾靜脈注射，導(dǎo)致靶基因特異性抑制[2830]。這些數(shù)據(jù)表明，一個(gè)活躍的shRNA通過(guò)血液的直接應(yīng)用是主要可行的。