核酸的結(jié)構(gòu)與功能-閱讀頁(yè)
2025-08-16 15:03本頁(yè)面
【正文】 沖液中和 ， 高鹽下通過(guò)毛吸作用將 DNA從凝膠中 轉(zhuǎn)印 至硝酸纖維素濾膜上 ④ 將硝酸纖維素濾膜 烘干 固定 。 Southern印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標(biāo)記DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液轉(zhuǎn)移 DNA 吸附有 DNA片段的膜 堿變性 Section 6 核酸的水解 （一）酸、堿水解 ? 核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。如果提高溫度或酸的濃度，可使 DNA和 RNA全部水解，得到堿基、戊糖、磷酸三種產(chǎn)物。 ? RNA對(duì)堿不穩(wěn)定，易被水解。 ? 這種水解性能上的差別，與 RNA核糖基上 2′ OH參與作用 有關(guān)。 ? 在克隆上的應(yīng)用： ? mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 ? mRNA ? cDNA 堿水解 ? cDNA 復(fù)制 （二）酶水解 A 定義： 生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。 B 分類： ? 以底物分類： DNA為底物的 DNA水解酶（ DNases） RNA為底物的 RNA水解酶（ RNases） ? 根據(jù)作用方式又分作兩類： 。 限制性核酸內(nèi)切酶： ?作用于鏈的內(nèi)部，具有嚴(yán)格序列依賴性。 ?基因工程中最常用的工具酶之一 —— 基因工程的 手術(shù)刀 ?沒(méi)有限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，就很難有今天分子生物學(xué)與基因工程的快速發(fā)展。 （一） DNA分離純化 ?真核 DNA以核蛋白（ DNP）形式存在，DNP溶于水和濃鹽（ 1mol/L） ,但不溶于,利用此性質(zhì) ,可將 DNP與 RNA核蛋白分開(kāi) ,提取出 DNP。還可用氯仿－異戊醇去除蛋白質(zhì) （二） RNA分離純化 ? 用 ，上清中即為 RNA核蛋白（ RNP）。必須防止 RNA酶對(duì) RNA的破壞。 ：遷移率與凝膠濃度成反比。 4. 電流：不大于 5V/cm。 三、 DNA堿基序列測(cè)定 DNA堿基序列測(cè)定即 DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定， ?測(cè)定未知序列 ?確定重組 DNA的方向與結(jié)構(gòu) ?對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定 ?比較研究 ?70年代末， Walter Gilbert發(fā)明化學(xué)法 Frederick Sanger發(fā)明雙脫氧終止法 手動(dòng)測(cè)序，同位素標(biāo)記 ?80年代中期，出現(xiàn)自動(dòng)測(cè)序儀（應(yīng)用雙脫氧終止法原理） ? 熒光代替同位素，計(jì)算機(jī)圖象識(shí)別 ?90年代中期，測(cè)序儀重大改進(jìn) ? 集束化的毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳 ?2022年完成人類基因組框架圖 ?利用 DNA聚合酶的酶促特點(diǎn) ? 以單鏈為模板合成 DNA的互補(bǔ)鏈 ? 利用 2’,3’雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之連接在 DNA鏈的 3’末段，終止鏈的延長(zhǎng)。 可將待測(cè) DNA片段與噬菌體 M13DNA進(jìn)行重組 ， 然后將其導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行增殖 ， M13噬菌體一般以單鏈 DNA形式透出細(xì)胞再感染新的細(xì)菌 ， 故此可獲得單鏈 DNA模板 。端合成一段互補(bǔ)的寡核苷酸引物 ， 其順序可為待測(cè) DNA片段 339。 可利用 DNA合成儀自動(dòng)合成 。端進(jìn)行雜交 。 此外還需分別加入一種 雙脫氧核糖核酸 （ ddATP， ddGTP， ddCTP或 ddTTP） 。 因在互補(bǔ)鏈合成時(shí) ， 如摻入的是雙脫氧核糖核酸 ， 由于缺乏 3`和 2`OH， 故可導(dǎo)致互補(bǔ)鏈合成終止 。 6． 放射自顯影： ?將電泳凝膠與 X光膠片壓在一起 ， 于低溫下自顯影數(shù)天 ， 即可得到放射自顯圖譜 ，通過(guò)該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列順序 。 自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 確定四種熒光發(fā)色基團(tuán)標(biāo)記 4種脫氧核糖核酸（ ddNTP） ——即賦予四組 DNA以不同的“顏色” 熒光基團(tuán)選擇標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)記方法 標(biāo)記引物 特定的熒光標(biāo)記引物與特定的 ddNTP保持一致 管 1 5’● — + ddATP 管 2 5’◆ — + ddCTP 管 3 5’★ — + ddGTP 管 4 5’▲ — + ddTTP 標(biāo)記底物 將熒光素連在 4種 ddNTP ddATP● ddCTP◆ ddGTP★ ddTTP▲ 高速自動(dòng) DNA測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理 ?測(cè)序反應(yīng)流程 待測(cè)模板 準(zhǔn)備 DNA模板 計(jì)算待測(cè)模板用量 DNA模板的使用量依據(jù) DNA的形式而定 質(zhì)粒模板變性 96℃ ， 2分鐘，冷卻至室溫后加入其他成分 (PCR產(chǎn)物不需變性 )。 ?每一雙鏈的 DNA模板 ， 經(jīng)過(guò)一次 解鏈 、退火 、 延伸 三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈 DNA分子 。PCR產(chǎn)物得以 2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增 ，經(jīng)過(guò) 25～ 30個(gè)循環(huán)后 ， 理論上可使基因擴(kuò)增 109倍以上 ， 實(shí)際上一般可達(dá) 106～107倍 。 2． 模板 DNA： 即待分析的目的 DNA， 其長(zhǎng)度不宜大于 10kb。 4． 四種脫氧核糖核苷酸 ：用作底物的dNTPS。 （三） PCR的反應(yīng)原理 ?PCR反應(yīng)時(shí) ， 一般采用 變性 復(fù)性 延伸 三步循環(huán) ， 也可采用 變性 延伸 兩步循環(huán) 。 2． 復(fù)性： 通過(guò)降低反應(yīng)溫度至 550C， 使兩種引物能與兩條解開(kāi)的 DNA互補(bǔ)鏈的 3`端粘合 ， 以提供 DNA聚合酶催化聚合所需的 3`OH。 ?按照上述步驟重復(fù)操作約 30次 ， 即可將模板 DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍 。 主要采用的方法有： ① 利用特異性引物以cDNA或基因組 DNA為模板 ， 獲得已知的目的基因； ② 利用簡(jiǎn)并引物從 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有同源性的DNA片段； ③ 利用隨機(jī)引物從 cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中隨機(jī)獲得目的基因 。 基因的定位分析： 原位 PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行 PCR反應(yīng) ， 它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的 PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) DNA的微量分析： ?由于 PCR技術(shù)具有高度敏感性 ， 故可用于微量 DNA的分
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